尊敬的审查员：

您好！申请人收到了国家知识产权局对申请号为2016105608718发出的第一次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动，申请人仔细阅读了审查意见通知书正文，申请人提出以下意见，希望和审查员商榷。

一、修改说明：

1.将权利要求2和3中的附加技术特征加入到权利要求1中，形成新的权利要求1.

2.删除权利要求2和3，并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系。

以上修改均没有超出原说明书和权利要求书记载的范围，详见修改后的权利要书。

二、关于修改后的权利要求1的创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于：1）在培养2.5~3h后，采用差数贴壁法，将培养瓶中的液体转移至新的培养瓶中，重复此操作1~2次；2）所述胶原酶IV的浓度为1mg/ml；所述消化的时间为70min。

基于区别技术特征1），能够进一步减少成纤维细胞的污染，目的细胞可达到95%以上的纯度。

对比文件1 (H9N2亚型禽流感病毒对鸡输卵管致病性的研究，王晶钰等，中国兽医学报，500-503，公开日期为20130430)公开了鸡输卵管膨大部上皮细胞的原代培养方法，并没有公开上述区别技术特征，也无法达到本发明“目的细胞可达到95%以上的纯度”的技术效果；因此，本申请相对于对比文件1具有预料不到的技术效果。

对比文件2(含钒蛋黄粉对大鼠生长、氧化应激状态及其相关基因表达的影响，崔仁勇等，动物营养学报，1956-1964,公开日期为20160531)公开了钒是一种重金属，过量的摄入会造成蛋鸡氧化应激，降低鸡蛋品质并残留到鸡蛋中，影响 鸡蛋的安全（参见对比文件2摘要）。与“蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞的培养方法”没有任何关联，因此，对比文件1和2相结合对本申请不具有技术启示。

基于区别技术特征2），胶原酶IV（Sigma）用于将目的细胞从组织上消化下来，形成单个细胞。选择1mg/ml的胶原酶IV，是由于此浓度酶作用下，在能将细胞消化下来的情况下，对细胞损伤较小，消化下来的细胞较容易贴壁和生长。置于37℃水浴消化70min；选择此时间是因为能够较大程度的将上皮细胞消化下来，时间过长可能消化下来的成纤维细胞比较多。

对比文件1(H9N2亚型禽流感病毒对鸡输卵管致病性的研究，王晶钰等，中国兽医学报，500-503，公开日期为20130430)公开了鸡输卵管膨大部上皮细胞的原代培养方法，首先对比文件1是对鸡输卵管膨大部上皮细胞的原代培养，采用胶原酶I，消化时间为30min，本申请是对蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞的培养方法，采用的是1mg/ml的胶原酶IV，且消化时间为70min；两者技术方案完全不同；本申请对细胞损伤较小，消化下来的细胞较容易贴壁和生长；对比文件1并没有公开上述技术效果，因此，本申请相对于对比文件1具有预料不到的技术效果。

对比文件2(含钒蛋黄粉对大鼠生长、氧化应激状态及其相关基因表达的影响，崔仁勇等，动物营养学报，1956-1964,公开日期为20160531)公开了钒是一种重金属，过量的摄入会造成蛋鸡氧化应激，降低鸡蛋品质并残留到鸡蛋中，影响 鸡蛋的安全（参见对比文件2摘要）。与“蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞的培养方法”没有任何关联，因此，对比文件1和2相结合对本申请不具有技术启示。

此外，审查员认为：从属权利要求2限定了后续培养的操作，从属权利要求3限定了胶原酶的浓度和消化时间，上述具体限定， 是本领域技术人员在对比文件1公开内容的基础上，结合本领域的惯用技术手段和有限的试验易于确定的， 无需付出创造性的劳动，而且本申请说明书也并未提供实验数据证明上述具体限定给本发明带来了预料不到 的技术效果。

申请人并不这样认为，首先，本申请采用上述区别技术特征，能够使目的细胞可达到95%以上的纯度，且对细胞损伤较小，消化下来的细胞较容易贴壁和生长。再次，本申请人申请人作为本领域的技术人员，并没有听说过采用上述区别技术特征，以达到上述技术效果的应用。第三，若上述区別技术特征为本领域的惯用手段，那么应备很容易在教科书、技术手册和/或工具书中找到，但是由请人并未在在教科书、技术手册和/或工具书中找到相关记载，若审查员坚持认为上述区别技术特征为惯用手段，敬请审查员举证。

因此，本申请相对于对比文件1、2及公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。

三、关于修改后的权利要求2-3的创造性

在修改后的权利要求1具有创造性的前提下，其从属权利要求2-3也必然具有创造性。

四、关于修改后的权利要求4的创造性

修改后的权利要求4与修改后的权利要求1具有单一性，在修改后的权利要求1具有创造性的前提下，权利要求4也必然具有创造性。

五、关于修改后的权利要求5-8的创造性

在修改后的权利要求4具有创造性的前提下，其从属权利要求5-8也必然具有创造性。

综上所述，本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。如有问题，望及时联系申请人，给予再次答复的机会，联系电话：028-87763797。

请审查员继续审查。

致礼