尊敬的审查员：

您好！申请人收到了国家知识产权局对申请号为201710321625.1发出的第一次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动，申请人仔细阅读了审查意见通知书正文，申请人提出以下意见，希望和审查员商榷。

一、修改说明：

1. 将权利要求2、5和6中的附加技术特征加入到权利要求1中，形成新的权利要求1。

2.删除权利要求2、5和6，并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系，详见修改后的权利要求书。

以上修改均没有超出原说明书和权利要求书记载的范围，详见修改后的权利要求书。

二、关于修改后的权利要求1的创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于：1）所述制备单细胞悬液，具体为：将获取的胸腺或脾脏组织用机械破碎法获得单细胞，过滤、洗涤后，用预冷的PBS液稀释细胞，获得浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL单细胞悬液，于4℃保存备用；2）使用流式细胞仪进行检测以及调节电压和电流线性增益参数；3）所述设定阴性区具体为：用阴性设置管上流式细胞仪，设定散点图中十字门左下方的区域为阴性区，调节电压使阴性区内细胞百分比大于98%。

基于上述区别技术特征，单细胞液的浓度过低会导致上机时每秒收集细胞数量过少；单细胞液浓度过高则可导致目标细胞不能被充分染色；由图1-图5可知，通过上述内容可以看出，本发明实施例提供的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，主要包括对以下几个方面的改进：一是调节荧光补偿时，应正确展示脾脏中CD4⁺CD8⁺T细胞占比例较少而胸腺中CD4⁺CD8⁺T细胞占比例较多的情况；二是在FSC和SSC二维象限图中，要圈取尽量多的脾脏或胸腺组织细胞进行结果分析；三是在分析结果时，除获得常规T淋巴细胞亚群指标，即CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ T细胞百分率外，还应记录CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺细胞的百分比，以考察试验因素是否干扰小鼠胸腺或脾脏中CD4⁺CD8⁺T细胞向对应的单阳性T细胞的增殖分化。从而建立了一种稳定规范的小鼠胸腺或脾脏 T淋巴细胞亚群的流式细胞仪检测方法。

对比文件1(“固始鸡免疫器官内T淋巴细胞亚群动态变化”，李奎等，中国兽医学报，第29卷第10期，第1315-1318页，2009年10月31日）公开了一种鸡胸腺T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，没有公开使用流式细胞仪进行检测以及调节电压和电流线性增益参数这一技术方案，即本申请相对于对比文件1技术方案不同，本申请相对于对比文件1具有突出的实质性特点，根据本发明的背景技术可知，常规的流式细胞仪在样本前处理、检测时的参数调节、结果分析时的处理方式在一定程度上都会影响检测结果，造成检测值波动范围大、检测结果不稳定，这也是对比文件1所存在的技术困难，本申请克服了对比文件1所不能克服的技术困难，因此，本发明相对于对比文件1具有预料不到的技术效果。

对比文件2(“帕金森病患者外周血T淋巴细胞检测及临床意义”，余能伟等，四川医学，第33卷第8 期，第1465-1468页，2012年8月31日）公开了一种使用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的方法，对比文件2也没有具体的“调节电压和电流线性增益参数”这一技术方案，根据本发明的背景技术可知，常规的流式细胞仪在样本前处理、检测时的参数调节、结果分析时的处理方式在一定程度上都会影响检测结果，造成检测值波动范围大、检测结果不稳定，这也是对比文件2所存在的技术困难，本申请克服了对比文件2所不能克服的技术困难，因此，本发明相对于对比文件2具有预料不到的技术效果，另外，对比文件1和2均没有公开上述区别技术特征和技术效果，对比文件1和对比文件2无法结合对本申请构成技术启示。

另外，审查员还认为：进行荧光补偿操作是采用流式细胞仪进行数据采集时的惯用操作手段（例如：教材(“临床免疫学检验”，吕世静，中国医药科技出版社，第183-186页，2010年1月31日；“免疫学教程”，郭焱等，清华大学出版社，第344-350页，2015年12月31日）公开了在流式细胞分析中，可以利用荧光补偿技术从被测荧光信号中去除其他干扰信号，以克服这种技术引起的误差；

申请人认为：根据本发明背景技术的记载：常规的流式细胞仪在样本前处理、检测时的参数调节、结果分析时的处理方式在一定程度上都会影响检测结果，造成检测值波动范围大、检测结果不稳定，本申请正好克服了这些技术困难，此外，本申请需要调节电压使阴性区内细胞百分比大于98%，且在调节荧光补偿时，应根据脾脏中CD4⁺CD8⁺细胞数量很少，而胸腺中CD4⁺CD8⁺细胞数量较多的特点，正确调节荧光补偿。在CD4和CD8的双参数图中，调节脾脏CD4⁺CD8⁺细胞的比例小于5%；胸腺CD4⁺CD8⁺细胞的比例大于60%；这样，左上角和右下角的CD4和CD8单阳性细胞与左下角的阴性细胞之间有较明显的分界。其次，在本申请提出的时候，申请人作为本领域的技术人员，并没有听说过上述应用。再次，若上述区別技术特征3为本领域的公知常识。那么应备很容易在教科书、技术手册和/或工具书中找到，但是由请人并未在在教科书、技术手册和/或工具书中找到相关记载，若审查员坚持认为上述区别技术特征为公知常识，敬请审查员举证。

因此，本申请相对于对比文件1、2以及公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。

三、关于修改后的权利要求2-6的创造性

在修改后的权利要求1具有创造性的前提下，其从属权利要求2-6也必然具有创造性。

综上所述，本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。如有问题，望及时联系申请人，给予再次答复的机会，联系电话：028-87763797。

请审查员继续审查。

致礼