尊敬的审查员：

您好！申请人收到了国家知识产权局对申请号为201610819977.5发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动，申请人仔细阅读了审查意见通知书正文，申请人提出以下意见，希望和审查员商榷。

一、修改说明：

1.将权利要求2和3中的附加技术特征加入到权利要求1中，形成新的权利要求1。

2.删除权利要求2和3，并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系。

以上修改均没有超出原说明书和权利要求书记载的范围，详见修改后的权利要求书。

二、关于修改后的权利要求1的创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于：1）将pGGsC/pGGeC、pDEST14-OsKSL与pCDF- AtCPR1-CYP71Z18三种重组质粒各100-150ng同时加入40μL大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激1min30s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL复苏2h，再涂布于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃过夜培养，第二天挑选平均菌落，置于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃，过夜摇菌制备得到6种菌种；这些菌种为大肠杆菌C41(DE3)背景株系，且每个菌种分别含有三种质粒：

① pGGsC，pDEST14-OsKSL4，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

②pGGsC，pDEST14-OsKSL8，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

③pGGsC，pDEST14-OsKSL10，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

④pGGsC，pDEST14-OsKSL11，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

⑤pGGeC，pDEST14-OsKSL7，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

⑥pGGeC，pDEST14-OsKSL10，pCDF- AtCPR1-CYP71Z18；

次日取1mL菌种置于50mL TB液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃，200rpm培养，菌液养至A₆₀₀达到0.8-1.0，向其中加入1 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，并在诱导表达时加入细胞色素P450反应所需辅因子75mg/L δ-氨基乙酰丙酸，1mM 硫胺素，5mg/L核黄素；然后转至16 °C，200rpm诱导培养72 h；72 h后用等体积的正己烷萃取萜类产物；所有的产物都经过叠氮甲烷甲基化后用于GC-MS检测羧酸类产物，制备得到羧酸类产物；

2）酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，去离子水1L，用1mol/L的NaOH调PH值至7.0；高压灭菌，4℃保存；固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂；

3）所述TB液体培养基具体为：NaCl 5g，MgSO₄.7H₂O 2g，酵母提取物24g，水解酪蛋白12g，甘油20mL，去离子水900mL；10×TB缓冲液：KH₂PO₄2.31g，K₂HPO₄12.54g，去离子水100mL；高压灭菌，4℃保存，使用时加入10×TB缓冲液100mL。

基于区别技术特征，本发明是根据三个质粒共转而进行修改后的方法，将水稻合成二萜化合物的基因进行共转，可以以各种水稻二萜为底物，体现催化底物多样性以及催化功能的多样性。

在该方法中，由说明书及附图2-图15可知，CYP71Z18催化syn-pimaradiene形成生成分子量为288(m/z)的新物质，通过核磁共振分析鉴定该产物为syn-pimaradiene的C15和C16位碳原子被环氧化的产物，是一种未被报道的新物质。CYP71Z18蛋白酶催化syn-stemarene生成甲基化后分子量为318(m/z)的新物质，其保留时间为19.778分钟；CYP71Z18蛋白酶催化syn-labdatriene生成分子量为304(m/z)和甲基化后分子量为316(m/z)的新物质，其保留时间分别为20.464分钟和19.527分钟；CYP71Z18蛋白酶催化syn-stemodene生成分子量为288(m/z)和甲基化后分子量为318(m/z)的新物质，其保留时间分别为20.361分钟和21.350分钟。CYP71Z18蛋白酶催化ent-cassadiene生成分子量为288(m/z)的新物质，其保留时间为21.935分钟；CYP71Z18蛋白酶催化ent-sandaracopimaradiene生成分子量为288(m/z)的新物质，其保留时间为19.414分钟。

对比文件1公开了采用代谢工程的方法分析CYP71Z18在水稻中的应用，将CYP71Z18以及其他基因共同转入大肠杆菌，用于提供合成底物以及必要的还原等价物，在液体培养基中进行培养，但是没有公开具体的培养基成分以及具体制备得到的菌种，即，两者的技术方案不同，本发明根据所述的菌种制备得到了二萜类物质（C20为二萜类物质），而且可以催化多个二萜类物质；对比文件1制备得到倍半萜化合物（C15），因此，本发明相对于对比文件1具有预料不到的技术效果。

另外，审查员认为：对比文件1已经公开了CYP71Z18基因，其和本申请完全一致，在提供合成底物以及必要的还原等价物的前提下，该基因能够合成多种二萜类物质，将C15类物质转化为羧酸类物质，由此可见，针对不同的底物，能够催化产生获得不同的二帖类物质，本领域技术人员在面对在提供不同的底物的技术问题时，有启示研究该CYP71Z18蛋白催化的产物，并且通过常规检测手段进行鉴定，这并不存在技术上的障碍。

申请人并不这样认为，申请人认为：首先，“该基因能够合成多种二萜类物质，将C15类物质转化为羧酸类物质，由此可见，针对不同的底物，能够催化产生获得不同的二帖类物质”表达有误，二萜类物质的C含量为20个，C15类物质属于倍半萜化合物，这是基于之前报道的CYP71Z18参与zealexin生物合成，催化β–macrocarpene C15的甲基形成羧基（Mao H, Jiang L, Fei R, et al. Characterization of CYP71Z18 indicates a role in maize zealexin biosynthesis[J]. Phytochemistry, 2015, 121:4-10.）一文，原理是在C15骨架上进行修饰形成羧酸类化合物。对比文件1并没有公开该基因在二萜类化合物中的应用。其次，由本发明的背景技术可知，“水稻产生20多种二萜类植保素，几乎所有相关的萜类合酶都通过重组表达酶的生化方式被鉴定了功能(Xu M, Wilderman P R, Morrone D, et al. Functional characterization of the rice kaurene synthase-like gene family[J]. Phytochemistry, 2007, 68(3):312-26.)。另一方面，P450催化特性各异，然而如何利用其多样的催化功能将水稻中多种二萜底物转化成新的产物还未见报道。”因此，如何利用其多样的催化功能将水稻中多种二萜底物转化成新的产物是现有技术中存在的技术困难，即，本申请克服了现有技术中存在的技术困难，此外，上述区别技术特征也不是本领域的公知常识，因此，本发明相对于对比文件1具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。

三、关于修改后的权利要求2的创造性

修改后的权利要求2与修改后的权利要求1具有单一性，在修改后的权利要求1具有创造性的前提下，权利要求2也必然具有创造性。

综上所述，本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。如有问题，望及时联系申请人，给予再次答复的机会，联系电话：028-87763797。

请审查员继续审查。

致礼