尊敬的审查员：

您好！申请人收到了国家知识产权局对申请号为201710321625.1发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动，申请人仔细阅读了审查意见通知书正文，申请人提出以下意见，希望和审查员商榷。

一、修改说明：

1. 将权利要求5中的附加技术特征加入到权利要求1中，形成新的权利要求1。

2.删除权利要求5，并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系，详见修改后的权利要求书。

以上修改均没有超出原说明书和权利要求书记载的范围，详见修改后的权利要求书。

二、关于修改后的权利要求1的创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于：所述分析检测结果，包括：圈取目标细胞并设门、分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比，从而获得小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群比例。

基于上述区别技术特征，用FlowJo7.6或Cell quest软件分析检测结果。在FSC/SSC双参数图中用门（gate）圈出目标细胞群，应圈取除碎片外98%以上的脾脏或胸腺组织细胞并设门。如图1所示，在FSC/SSC双参数图中，脾脏细胞显示为左稀疏右致密两团，胸腺细胞显示为左致密右稀疏的两团，应同时圈取两团细胞；再用阴性区设置数据分别在CD3/CD4、CD3/CD8和CD4/CD8象限图中划十字门，十字门位置按阴性区细胞数量小于98%的标准设定；用检测结果数据进一步做分析，采用前述的十字门位置设置阴性区，进而获得CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值。

实验观察到腹腔注射环磷酰胺导致小鼠脾脏中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、和CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比降低（图4），表明环磷酰胺导致小鼠免疫抑制的机理与脾脏中T淋巴细胞的成熟分化受到抑制有关；小鼠胸腺中的CD4⁺CD8⁺细胞百分比升高（图5），表明CD4、CD8双阳性细胞向单阳性细胞的选择分化过程可能受到了环磷酰胺的干扰。

对比文件1(“固始鸡免疫器官内T淋巴细胞亚群动态变化”，李奎等，中国兽医学报，第29卷第10期，第1315-1318页，2009年10月31日）公开了一种鸡胸腺T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，没有公开上述区别技术特征，即本申请相对于对比文件1技术方案不同，本申请相对于对比文件1具有突出的实质性特点，也无法获得“CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值”，因此，本发明相对于对比文件1具有预料不到的技术效果。

对比文件2(“帕金森病患者外周血T淋巴细胞检测及临床意义”，余能伟等，四川医学，第33卷第8 期，第1465-1468页，2012年8月31日）公开了一种使用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的方法，对比文件2也没有“所述分析检测结果，包括：圈取目标细胞并设门、分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+ 、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，从而获得小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群比例”，也无法获得“CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值”，因此，本发明相对于对比文件2具有预料不到的技术效果，另外，对比文件1和2均没有公开上述区别技术特征和技术效果，对比文件1和对比文件2无法结合对本申请构成技术启示。

审查员认为：在此基础上，圈取目标细胞并设门时，要求圈取除碎片以外98%以上的胸腺或脾脏组织细胞，并分别在 CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取 CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺CD8\ CD4—CD8⁺和 CD4⁺CD8⁺T 淋巴细胞百分比，从而获得小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群比例，是本领域技术人员根据设置的单克隆抗体的种类以及前向散射光/侧向散射光双参数图分析原理做出的常规操作。

申请人并不这样认为，申请人认为：首先，本发明“所述分析检测结果，包括：圈取目标细胞并设门、分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+ 、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，从而获得小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群比例”是为了获得合理的“CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值”，并非仅是公知常识的运用或常规选择。其次，在本申请提出的时候，申请人作为本领域的技术人员，并没有听说过采用上述区别技术特征，以能够获得合理的“CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比值”的应用。再次，若上述区別技术特征为本领域的公知常识或者常规选择，那么应备很容易在教科书、技术手册和/或工具书中找到，但是申请人并未在在教科书、技术手册和/或工具书中找到相关记载，若审查员坚持认为上述区别技术特征为公知常识或者常规选择，敬请审查员举证。

因此，本申请相对于对比文件1、2以及公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。

三、关于修改后的权利要求2-5的创造性

在修改后的权利要求1具有创造性的前提下，其从属权利要求2-5也必然具有创造性。

综上所述，本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步，因而具有创造性。如有问题，望及时联系申请人，给予再次答复的机会，联系电话：13551134124。

请审查员继续审查。

致礼