1. 一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1DNA提取:采用粪便基因组提取试剂盒,将肉鸡盲肠内容物总DNA提取于1.5mLEP管中,测其核酸浓度,灭菌超纯水稀释到20ng/μL,与原液一起保存于-20℃冰箱,待用;

步骤2、合成肉鸡肠道微生物PCR引物;所述PCR引物的上游引物为CGATGAGTGCTAGGTGTTGGA,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;下游引物为CAAGATGTCAAGACCTGGTAAG,序列如SEQ ID NO.2所示;

步骤3构建肉鸡肠道微生物质粒:

1)以肉鸡肠道内容物总DNA为模板,用步骤1中的引物进行PCR扩增,按照PCR反应体系扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶DNA小量回收试剂盒回收纯化目的片段,测OD值,-20℃保存;

2)用试剂盒将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化,按照说明书制备10μL连接混合液,16℃,30min1μL混合液加入10μL DH5α冰上30min,做一个重复组;42℃热激90s,冰上3min500μLLB培养基,37℃,复苏45-60min220RPM/min4000RPM/min离心,2min,弃400μL,重悬,LA平板上涂板,37℃过夜培养,不超过16h

3)挑取单菌落白斑,于10uL液体LA培养基中,取1uL进行菌落PCR,剩下的加500uL的液体LA培养基;PCR结果阳性的菌液测序;

4)测序结果在blast上比对,阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒;

5)质粒测序,NCBIblast比对结果,挑选与目的菌株匹配的质粒,检测DNA浓度,保存于-20℃冰箱,备用。

步骤4制作标准品;

步骤5、进行样品检测。

2根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,所述步骤4中制备标准品具体为:将质粒按十倍稀释法,用灭菌超纯水稀释成10-1-10-9的浓度梯度,取9个无菌的1.5mLEP管,根据浓度由大到小依次编号1-9并各加入90μL灭菌的超纯水,取肉鸡肠道微生物标准质粒原液10μL于试管中,快速轻柔吹打20-30次,重复该步骤至9EP管,得到包括原液的10个梯度的标准品。

3根据权利要求2所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,所述步骤5中样品检测具体为:选取3-7号标准品与样品稀释液一起进行荧光定量PCR反应;试验所用设备为Bio-Rad 96孔荧光定量PCR仪。

4、根据权利要求13所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,PCR反应的反应体系为上游引物和下游引物各0.8μLRNase-Free ddH2O 7.4μLSYBR GREEN Supermix 10μLDNA模板1μL

5、根据权利要求3所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,所述荧光定量PCR反应的反应条件:预变性阶段,1次循环,温度95℃,预变性30s,不采集荧光信号;PCR反应阶段,40次循环,温度95℃,变性5s,退火温度50-60℃,时间30s,温度72℃,延伸20s,采集荧光信号;溶解曲线,72℃到95℃,每2s上升0.5℃。

6、根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,所述微生物为总菌、乳杆菌或大肠杆菌中的一种。