本发明涉及一种染料荧光定量RT-PCR引物、试剂盒及其应用。该引物包括上游引物MRV F和下游引物MRV R,并且所述上游引物MRV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述下游引物MRV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的特异性引物及试剂盒可对哺乳动物正呼肠孤病毒进行快速、准确地鉴别,具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。