1. 一种ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白,其特征在于,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。
2. 一种如权利要求1所述的ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:
1)将SEQ ID NO:1所示的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间,得到重组质粒pET28a/ZmEDS;
2)对pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变,分别制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS- V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒;分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸,并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异,其蛋白序列分别如SEQ ID NO:3-6所示;
3)将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS- G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同时加入25 μL大肠杆菌BL21感受态细胞中,其中,重组质粒各100-150ng,冰浴20 min,42℃热激1 min20 s,冰上冷却2 min后加入液体LB培养基200 μL,37℃ 200 rpm下复苏1.5 h,再涂布于含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的固体LB培养基平板上;37℃倒置过夜培养,第二天划线取平均菌落,置于同时含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的5 mL液体LB培养基中,37℃ 200 rpm过夜培养;制备得到上述五种菌种,菌种为大肠杆菌BL21背景株系,且每个菌种分别含有两种质粒:
①pMEVT/MBIS,pET28a/ZmEDS;
②pMEVT/MBIS,ZmEDS-F303A;
③pMEVT/MBIS,ZmEDS-G411C;
④pMEVT/MBIS,ZmEDS-V306A;
⑤pMEVT/MBIS,ZmEDS-I279G;
次日取2 mL上述菌种置于50 mL NZY液体培养基,培养基中加入相应的抗生素,37°C 200 rpm培养,菌液培养至A600达到0.8-1.0,向其中加入1 M的IPTG终浓度至1 mM,然后将菌液转至16 °C,200 rpm诱导培养24 h;之后用等体积的正己烷萃取萜类产物,16°C 200 rpm萃取30 min;振荡充分后,取出静置,取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL,转移至GC样品瓶中,用于GC-MS检测,制备得到倍半萜类化合物。
4. 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤2中对pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变,制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS- V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒具体为:4只PCR管中分别加入20μg pET28a/ZmEDS质粒作为模板,然后依次分别加入0.5 μL前引物F、0.5 μL后引物R,0.4 μL高保真酶PrimerSTAR、0.4 μL浓度为10mM的dNTP、用无菌水补足至20 μL,其中,ZmEDS- F303A对应引物F303A-F/F303A-R、ZmEDS-G411C对应G411C-F/G411C-R、ZmEDS-V306A对应V306A-F/V306A-R、ZmEDS-I279G对应I279G-F/ I279G-R,引物序列分别如SEQ ID NO:11~18所示;将上述PCR管进行瞬时离心后,置于PCR仪进行反应,相应的PCR反应程序为:95℃ 5 min; 98℃ 10 s,60℃ 15 s,72℃ 7 min10 s,循环15次;72℃ 7 min;PCR反应完成后,取5 μL反应液用于1 % 的琼脂糖电泳检测,经100V 30 min电泳后,若检测到有大小为7 kb的核酸条带,则在相应剩余的15 μL反应液中加入1.5 μL限制性内切酶DpnI,瞬时混匀后,37℃进行过夜消化模板质粒;取10 μL消化后的反应液加入25 μL大肠杆菌 TOP10感受态中,冰浴20 min,42℃热激1 min,冰上冷却2 min后加入液体LB培养基200 μL,37℃ 200 rpm下复苏1 h,涂布于含有硫酸卡那霉素50 mg/L的固体LB培养基平板上;37℃倒置过夜培养,第二天挑选单菌落,置于含硫酸卡那霉素50 mg/L的 5 mL液体LB培养基中,37℃ 200 rpm过夜培养后,使用试剂盒提取质粒,并送样测序验证已在相应位点进行了定点突变,并且其他位点未发生突变;制备得到4种重组质粒分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G。
5. 根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述液体LB培养基具体为:酵母提取物5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,去离子水1 L,用1 M的NaOH调pH值至7.0;121°C高压灭菌20 min后,4°C保存;固体LB培养基在灭菌前加上15 g/L的琼脂。
6. 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述NZY液体培养基具体为:NaCl 5 g,MgSO4·7H2O 2 g,酵母提取物5 g,水解酪蛋白10 g,去离子水1 L,用1 M的NaOH调pH值至7.0;121°C高压灭菌20 min后,4°C保存。
7. 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述倍半萜类化合物包括eudesmane-2α,11-diol、3-epi-cryptomeridiol、2,3-epi-cryptomeridiol三种倍半萜二元醇和2-epi-α-eudesmol、(+)-hedycaryol、eremophil-6-en-11-ol和valerianol四种倍半萜一元醇。