尊敬的审查员,您好!

 

首先感谢您为本申请的审查工作付出的辛勤劳动。在本申请的第一次审查意见通知书中,审查意见认为权利要求1-10不具有创造性。

 

申请人仔细分析了上述意见,修改了权利要求书,并进行如下意见陈述,恳请审查员予以充分考虑。

 

一、关于权利要求书的修改

申请人在独立权利要求1中并入了原权利要求2中的特征,同时,删除原权利要求2,并将权利要求进行重新编号为1-9

 

显然,本次修改不可能存在修改超范围问题。

 

二、关于修改后的权利要求的创造性

 

1、申请人认为修改后的权利要求 1 具备创造性

 

修改后的权利要求1请求保护一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法:

 

1. 一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,包括:

S1:靶序列退火复性:根据选定的靶序列,合成互补的Oligo DNA,将合成的Oligo DNA序列进行退火复性获得DNA双链序列,并稀释;

S2PSG载体的酶切:采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体,酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收;

S3:连接和转化:配置连接体系,将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中;

S4:重组质粒的鉴定和提取:分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养,分别以M13 fwdOligo-R为引物进行菌液PCR鉴定,将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中,培养后进行质粒的提取,得到重组质粒;

S5:重组资料和PCC质粒的双酶切:将得到的重组质粒和PCC质粒进行双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段;

S6:连接、转化和鉴定:配置连接体系,将S5获得的酶切回收目标片段进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中,挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养,并进行菌液PCR鉴定,将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养,提取质粒,即获得构建好的CRISPR/Cas9载体;

所述PSG载体的构建包括:

pX330质粒为模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段回收该片段标记为sgRNA1引物序列为SEQ ID NO.1所示的Sg1-FSEQ ID NO.2所示的Sg1-R

使用EcoRI-HFXbaI分别双酶切pUC19sgRNA1,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;

pSG1质粒为模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段回收该片段标记为sgRNA引物序列为SEQ ID NO.3所示的Sg2-FSEQ ID NO.4所示的Sg2-R

使用EcoRI-HFXbaI双酶切pUC19,使用BsaI酶切sgRNA,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。

 

对比文件1公开了一种应用于单双子叶植物的CRISPR/Cas9 载体的方法,与对比文件1相比,本申请修改后的权利要求1至少具有以下区别技术特征:

 

S3:连接和转化:配置连接体系,将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中;

S4:重组质粒的鉴定和提取:分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养,分别以M13 fwdOligo-R为引物进行菌液PCR鉴定,将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中,培养后进行质粒的提取,得到重组质粒;

S5:重组资料和PCC质粒的双酶切:将得到的重组质粒和PCC质粒进行双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段;

S6:连接、转化和鉴定:配置连接体系,将S5获得的酶切回收目标片段进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中,挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养,并进行菌液PCR鉴定,将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养,提取质粒,即获得构建好的CRISPR/Cas9载体;

所述PSG载体的构建包括:

pX330质粒为模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段回收该片段标记为sgRNA1引物序列为SEQ ID NO.1所示的Sg1-FSEQ ID NO.2所示的Sg1-R

使用EcoRI-HFXbaI分别双酶切pUC19sgRNA1,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;

pSG1质粒为模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段回收该片段标记为sgRNA引物序列为SEQ ID NO.3所示的Sg2-FSEQ ID NO.4所示的Sg2-R

使用EcoRI-HFXbaI双酶切pUC19,使用BsaI酶切sgRNA,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。

 

上述区别特征未被对比文件1公开,且上述区别特征并不是如审查意见所说的为本领域技术人员基于分子生物学的常规技术手段,本申请发明人经过创造性劳动,以特别方式构建PSG载体,并通过一系列特别的方式完成CRISPR/Cas9载体的构建,使得构建的CRISPR/Cas9载体不仅能够作用于单个靶位点,而且能够同时作用于两个靶位点,使得修改后的权利要求1相对于对比文件具有非显而易见性。

 

因此,申请人认为,在对比文件1的基础上,不能结合任何现有技术获得本申请修改后的权利要求1的方案。本申请的发明人经过创新性思考和创造性地劳动,首次提出了上述特别的技术手段,具有突出的实质性特点和显著的进步,符合专利法第二十二条第三款规定的创造性。

 

另外,申请人申请的与本申请技术方案类似的另一专利,201710034569.3,一种应用于草莓上的CRISPRlCas9 载体的构建方法,经审查,已被批准授予专利权,因此,申请人认为,基于创造性评价标准的一致性,本申请修改后的权利要求1符合专利法第二十二条第三款规定的创造性。

 

2、修改后的权利要求2-9具备创造性

修改后的权利要求2-9作为修改后的独立权利要求1的从属权利要求,在修改后的独立权利要求1具有创造性的情况下,修改后的权利要求2-9也具有创造性。

 

希望审查员在考虑上述陈述意见后,早日批准本发明。最后,申请人衷心感谢审查员对本申请所付出的辛勤劳动和给予的答辩机会。