1. 一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,包括:
S1:靶序列退火复性:根据选定的靶序列,合成互补的Oligo DNA,将合成的Oligo DNA序列进行退火复性获得DNA双链序列,并稀释;
S2:PSG载体的酶切:采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体,酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收;
S3:连接和转化:配置连接体系,将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中;
S4:重组质粒的鉴定和提取:分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养,分别以M13 fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定,将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中,培养后进行质粒的提取,得到重组质粒;
S5:重组资料和PCC质粒的双酶切:将得到的重组质粒和PCC质粒进行双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段;
S6:连接、转化和鉴定:配置连接体系,将S5获得的酶切回收目标片段进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中,挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养,并进行菌液PCR鉴定,将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养,提取质粒,即获得构建好的CRISPR/Cas9载体;
所述PSG载体的构建包括:
以pX330质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段,回收该片段,标记为sgRNA1,引物序列为SEQ ID NO.1所示的Sg1-F和SEQ ID NO.2所示的Sg1-R;
使用EcoRI-HF和XbaI分别双酶切pUC19和sgRNA1,回收目的片段后按1:7的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;
以pSG1质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段,回收该片段,标记为sgRNA,引物序列为SEQ ID NO.3所示的Sg2-F和SEQ ID NO.4所示的Sg2-R;
使用EcoRI-HF和XbaI双酶切pUC19,使用BsaI酶切sgRNA,回收目的片段后按1:7的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。
2. 根据权利要求1所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,所述PCC载体的构建包括:
以pX330质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增hSpCas9片段,其中引物Cas-F:Cas-R1:Cas-R2=1.5:0.2:1.3,回收该片段,标记为hSpCas9,Cas-F的序列如SEQ ID NO.5所示,Cas-R1的序列如SEQ ID NO.6所示,Cas-R2的序列如SEQ ID NO.7所示;
使用NcoI-HF和BstEII-HF分别双酶切pCAMBIA1302和hSpCas9,回收目的片段后按1:5的摩尔比进行连接,得到重组质粒pCC1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;
以pCAMBIA1302质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增CaMV 35 enhanced promoter片段,回收该片段,标记为CaMV-ep,引物序列为SEQ ID NO.8所示的CaMV-ep-F和SEQ ID NO.9所示的CaMV-ep-R;
使用HindIII和NcoI分别双酶切pCC1和CaMV-ep,回收目的片段后按1:5的摩尔比进行连接,得到重组质粒pCC,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。
3. 根据权利要求2所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在步骤S1中,合成一对互补的Oligo DNA,即序列为SEQ ID NO.10所示的Oligo-F 和序列为SEQ ID NO.11所示的Oligo-R。
4. 根据权利要求2所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在步骤S1中,合成两对互补的Oligo DNA,分别为序列为SEQ ID NO.12所示的Oligo1-F,序列为SEQ ID NO.13所示的Oligo1-R,序列为SEQ ID NO.14所示的Oligo2-F及序列为SEQ ID NO.15所示的Oligo2-R。
5. 根据权利要求3或4所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在步骤S1中,将所述合成的Oligo DNA序列进行退火复性的反应程序为:95℃变性5min,每30s 降温1℃,降温至25℃,并于4℃保存;
在所述步骤S2中,PSG载体的酶切的反应体系为100µL,37℃反应过夜,65℃反应20min。
6. 根据权利要求3所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在所述步骤S4中,所得到的重组质粒为pSG-CZ;在所述步骤S5中,将得到的pSG-CZ重组质粒、pCC质粒分别采用EcoRI-HF和XbaI进行双酶切,37℃酶切3h后,65℃反应20min得到所述酶切产物。
7. 根据权利要求4所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在所述步骤S4中,所得到的重组质粒为pSG-CZ1和pSG-CZ2;所述步骤S5中,将得到的pSG-CZ1重组质粒采用EcoRI-HF和KpnI进行双酶切,pSG-CZ2重组质粒采用XbaI和KpnI进行双酶切;或将得到的pSG-CZ1重组质粒采用EcoRI-HF和BamHI进行双酶切,pSG-CZ2重组质粒采用XbaI和BamHI进行双酶切;并将pCC质粒采用EcoRI-HF和XbaI进行双酶切,37℃酶切3h后,65℃反应20min,得到所述酶切产物。
8. 根据权利要求3或6所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在所述步骤S6中,所述菌液PCR鉴定以M13 rev和Oligo-R为引物。
9. 根据权利要求4或7所述的应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,在所述步骤S6中,所述菌液PCR鉴定以Oligo1-F和Oligo2-R为引物。