尊敬的审查员,您好!
首先感谢您为本申请的审查工作付出的辛勤劳动。在本申请的第一次审查意见通知书中,审查意见认为权利要求1-8不具有创造性。
申请人仔细分析了上述意见,修改了权利要求书,并进行如下意见陈述,恳请审查员予以充分考虑。
一、关于权利要求书的修改
申请人在原独立权利要求1中并入了原权利要求3、4中的特征,同时,删除原权利要求3、4,并将权利要求重新编号为1-8。
显然,本次修改不可能存在修改超范围问题。
二、关于修改后的权利要求的创造性
1、申请人认为修改后的权利要求 1 具备创造性
修改后的权利要求1请求保护一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其具体限定如下所示:
1.
一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,包括:
草莓无菌苗的预培养:取草莓无菌苗,获得其叶盘或剪成小块,置于M1培养基中进行暗培养,获得预培养叶片;
农杆菌活化:取根癌农杆菌阳性单克隆于含抗生素的YEB液体培养基中,黑暗条件下振荡培养,获得菌液;取获得的菌液离心收菌,获得菌体沉淀;将获得的菌体沉淀重悬于M2培养基中,振荡培养,获得用于侵染的菌液;
侵染:将获得的所述预培养叶片置于所述用于侵染的菌液中,进行侵染处理;
共培养:吸干经侵染处理后的叶片表面的菌液,置于M3培养基中,进行暗培养;
延迟筛选:用M4洗涤液洗涤经共培养结束后的叶片,并吸干其表面的菌液,再接种于M5培养基上,进行暗培养;
筛选:将延迟筛选结束后的叶片转移至M6培养基中,光照和黑暗交替培养,培养结束后,切除坏死组织,将愈伤组织部分转接于M7培养基中,再光照和黑暗交替培养,直到分化出不定芽;
生根:待芽长长后,将其切下转移至M8培养基中再培养,得到完整植株;
所述M3培养基的成分包括MS无机盐、B5维生素、3%蔗糖、0.25%植物凝胶、2~3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50~100μmol/L的а-硫辛酸,且其PH值为5.5;
所述M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3%蔗糖、0.25%植物凝胶、2~3mg/L激素、480~500mg/L抗生素及50~100μmol/L井冈霉素A,且其PH值为5.8。
对比文件1公开了农杆菌介导的草莓植株的转化与再生的培养方法,与对比文件1相比,本申请修改后的权利要求1至少具有以下区别技术特征:
所述M3培养基的成分包括MS无机盐、B5维生素、3%蔗糖、0.25%植物凝胶、2~3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50~100μmol/L的а-硫辛酸,且其PH值为5.5;
所述M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3%蔗糖、0.25%植物凝胶、2~3mg/L激素、480~500mg/L抗生素及50~100μmol/L井冈霉素A,且其PH值为5.8。
针对上述区别特征,对比文件3 公开了在培养基中原加一定浓度的硫辛酸能够降低植物组培过程中的褐化率并提高芽增殖系数。对比文件1公开了在预筛选培养基中含有100μM的井冈霉素A。
申请人认为虽然对比文件3、对比文件1分别公开了培养基中可加入硫辛酸、井冈霉素A,但对比文件3、对比文件1中两种物质的加入时机和与之搭配的其他加入物质均不同,不能因为培养基的某一成分是现有技术公开的物质,就否定培养基在在成分组合、成分配比上的创造性。
本申请а-硫辛酸、井冈霉素A的加入时机和与之配合的其他成分均与现有技术不同,而由于培养基中成分的选择多样性和含量的不确定性,本领域技术人员很难依靠常规的有限次实验确定最佳的条件组合。
本申请通过在共培养和延迟筛选阶段分别加入а-硫辛酸、井冈霉素A,同时优化遗传转化步骤,可大幅度提高草莓转基因效率,解决传统农杆菌介导法转化效率低,易产生嵌合体,筛选困难,工作量大的问题,极大的提高了遗传转化效率,同时显著降低再生芽的假阳性率。
因此,申请人认为,在对比文件1的基础上,不能结合对比文件2及任何现有技术获得本申请修改后的权利要求1的方案。本申请的发明人经过创新性思考和创造性地劳动,首次提出了上述特别的技术手段,具有突出的实质性特点和显著的进步,符合专利法第二十二条第三款规定的创造性。
2、修改后的权利要求2-8具备创造性
修改后的权利要求2-8作为修改后的独立权利要求1的从属权利要求,在修改后的独立权利要求1具有创造性的情况下,修改后的权利要求2-8也具有创造性。
希望审查员在考虑上述陈述意见后,早日批准本发明。最后,申请人衷心感谢审查员对本申请所付出的辛勤劳动和给予的答辩机会。