1. 一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;

所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq1μL、反转录酶1.25μL、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物各3.5μL和牦牛轮状病毒探针0.25μLdNTPs 4μL;所述Taq酶的终浓度为5U·μL-1,反转录酶的终浓度为20U·μL-1,牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物的终浓度均为10 μmol·μL-1,牦牛轮状病毒探针的终浓度为10 μmol·μL-1dNTPs的终浓度为2.5 mM

牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3 '端连接有非荧光淬灭基团和BHQ

2. 根据权利要求1所述的基于恒温隔绝式荧光 PCR 平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到:将权利要求34所述的Taq酶、反转录酶、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针、dNTPs混合加入0.5mlPCR管中降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管,制得荧光定量PCR反应液冻干管。

3. 根据权利要求2所述的基于恒温隔绝式荧光 PCR 平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。

4. 根据权利要求1所述的基于恒温隔绝式荧光 PCR 平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述反应缓冲液由以下组分构成:500 mM KClpH 8.3100 mM Tris-HCl15 mM MgCl2,余量为ddH2O,以上体积总量为3ml

5. 根据权利要求1所述的基于恒温隔绝式荧光 PCR 平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将含有牦牛轮状病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内,降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成;

阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将无牦牛轮状病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内,降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成。

6. 根据权利要求1所述的基于恒温隔绝式荧光 PCR 平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒保存于4℃下。

7. 一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒的使用方法,其特征在于,所述方法为非疾病的诊断和治疗目的;包括以下步骤:

1)制备RNA模板:取粪便样本上清液200μL,参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA,制备得到RNA模板;

2)荧光PCR反应体系的制备:荧光PCR反应体系的制备于冰上操作;取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合,制备得到阳性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5µL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阳性对照反应体系;取100μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中,制备得到阴性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5µL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阴性对照反应体系;取50μL反应缓冲液和5µL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到检测样本RNA反应体系;然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中;加样时注意避光操作;将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5 s,避免出现气泡;

3)扩增检测:把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内,按运行键,即开始反应;

4)检测结果判定:“+”表示阳性,“-”表示阴性。