1. 竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)竹叶花椒中期染色体载玻片标本的制备:将竹叶花椒幼苗采用营养土培养,待根尖长至1.5~2.0cm时,剪取1~1.5cm根尖组织,依次用N2O处理3h、冰醋酸处理5min,然后置于75%酒精中于-20℃保存;

将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1~2mm,置于酶解液中于37℃酶解55min,去除酶解液,依次用双蒸水、75%酒精、95%酒精、100%酒精清洗根尖分生组织后室温晾干;在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液;将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检,镜检良好的玻片于-20℃保存;

2)荧光原位杂交:将载玻片置于4%多聚甲醛中处理10min,然后用2×SSC缓冲液处理两次,每次5min,再用双蒸水处理两次,每次5min,再依次用75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理,每次5min,室温晾干后滴加70% FA液,盖上盖玻片,于80℃变性2min;

载玻片变性完成后于5s内依次放入-20℃的75%酒精、95%酒精、100%酒精梯度处理,每次5min,室温晾干;在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液,盖上盖玻片,于黑暗条件下在杂交盒中于37℃恒温孵化1.5~2h;所述探针采用5S rDNA探针和(GAA)6探针,其中5S rDNA探针的碱基序列为:5′ -TCAGAACTCCGAAGTTAAGCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTAC- 3′,采用FAM标记其序列的5’端;(GAA)6探针的碱基序列为:5′ -GAAGAAGAAGAAGAAGAA- 3’, 采用TAMRM标记其序列的5’端;

将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2×SSC缓冲液清洗3min、双蒸水处理两次,每次5min,室温晾干;

3)信号检测:晾干后的载玻片上加入DAPI,盖上盖玻片,采用荧光显微镜对载玻片进行检测,采集检测图像;

4)载玻片回收:之后回收制片并放入2×SSC缓冲液中于60℃水浴5min,依次在75%酒精、95%酒精、100%酒精中梯度处理,每次5min,处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h;-20℃保存。

2. 根据权利要求1所述的竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,所述酶解液的配制方法为:每1mL的柠檬酸缓冲液中加入0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶;其中柠檬酸缓冲液的配制方法为:每50mL的ddH2O加0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸。

3. 根据权利要求1所述的竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,所述4%多聚甲醛液的配制方法为:每100mL的1×PBS缓冲液加入4g多聚甲醛,在60℃水浴锅中水浴2~3h,其中所述1×PBS缓冲液的配制方法为:每1000mL的ddH2O加入8g氯化钠,0.2g氯化钾,1.42g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾。

4. 根据权利要求1所述的竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,所述2×SSC缓冲液的配制方法为:每1000mL的ddH2O加入8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠。

5. 根据权利要求1所述的竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,所述70%FA液由去离子甲酰胺(FA)和2×SSC缓冲液按照体积比7:3组成。

6. 根据权利要求1所述的竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法,其特征在于,所述杂交缓冲液由等体积的1×TE和2×SSC缓冲液组成;其中1×TE的配制方法为:每800mL的ddH2O中加入1.211g Tris和0.372g EDTANa2•2H2O,用HCl调pH到8.0,定容到1000mL,灭菌后即得。