1. 一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,包括处死、卵巢处理、消化、过滤、离心洗涤、分离的步骤,其特征在于:所述卵巢处理步骤中对卵巢进行初步剪碎后,使用匀浆操作破碎卵巢组织3-10min;所述分离步骤中在体视显微镜下分离并测量单个卵泡;
由以下步骤组成:
(1)处死:将鹅颈动脉放血处死,取出卵巢清洗;
(2)卵巢处理:去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织;对卵巢进行初步剪碎后,使用匀浆操作破碎卵巢组织;过滤;
(3)消化:加入混合消化液消化,而后加入胎牛血清终止消化;
(4)过滤:过滤后获得卵泡悬液;
(5)离心洗涤:反复离心洗涤,收集卵泡沉淀于α-MEM培养基中;
(6)分离:在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。
2. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(1)将鹅处死后,用75%酒精棉擦拭鹅腹部后剪开腹部皮肤取出卵巢,将取得的卵巢放入70%的酒精清洗两次,再用生理盐水冲洗3次,最后转移至磷酸盐缓冲液中清洗2次。
3. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(2)使用匀浆机进行3-10min分钟的匀浆操作,转速为3600rpm,匀浆过程中多次冲洗匀浆机柱头,匀浆结束后使用70目不锈钢过滤网对卵泡悬液过滤,再使用磷酸盐缓冲液清洗滤网2次并收集滤液。
4. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(3)为37℃震荡水浴锅中消化30-50min。
5. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(3)混合消化液组成是:以α-MEM培养基为溶剂配置的150IU/ml DNaseⅠ和0.75mg/ml胶原酶的混合消化液。
6. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(4)将消化后的卵泡混合液用150目不锈钢过滤网过滤,并用细胞培养液冲洗过滤网,滤液使用灭菌培养皿收集,经轻微吹打后备用。
7. 如权利要求5或6所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述细胞培养液为α-MEM。
8. 如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法,其特征在于:所述步骤(6)为将卵泡混合液放于体视显微镜的恒温操作板上,在显微镜下使用已拉伸至目的直径的玻璃巴氏吸管吸取单个卵泡,将挑出的卵泡放入干净磷酸盐缓冲液中,而后放于倒置相差显微镜上,观察其直径和结构,按卵泡等级归类。