1. 一种基于POCKIT Micro荧光PCR的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品;
所述荧光定量PCR反应液包括细粒、多房棘球绦虫上游通用引物3.5μL,细粒、多房棘球绦虫下游通用引物3.5μL,细粒、多房棘球绦虫通用探针1.5μL,Taq酶1.5μL,预混buffer 25μL,去离子水14μL,总量为49μL,DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL;
所述细粒、多房棘球绦虫上游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述细粒、多房棘球绦虫通用探针如SEQ ID NO.3所示;
Taq酶的终浓度为6U·μL-1,细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的终浓度均为600nM,细粒、多房棘球绦虫通用探针的终浓度为400nM。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照品为:含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒,所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述阴性对照品为:无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒,由以下方法制备得到:
1)利用细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物,以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板,进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物;
2)将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上,构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒;
3)抽提质粒,定量并稀释至103拷贝/μl,制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒,即为阳性对照品。
4. 权利要求1所述的试剂盒定性检测犬细粒、多房棘球绦虫的方法,其特征在于,所述方法为非疾病的诊断和治疗目的;包括以下步骤 :
a)采用OMEGA Stool DNA Kit 基因组提取试剂盒从待检测的标本中提取 DNA,用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl,制备得到DNA 提取液;
b)以提取得到的DNA作为模板,加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中,对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板,将PCR管放置到POCKIT Micro荧光PCR仪中进行检测,42分钟以后判读结果。