尊敬的审查员:

本复审理由针对国家知识产权局于20201028日发出的关于《一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法》的驳回决定,对于审查员的意见,申请人进行了认真的研读,并提出以下理由。

1、审查员对本申请的驳回理由

审查员结合了对比文件1,评述了本申请权利要求1-9不具备专利法第22条第3款规定的创造性,具体分析如下:

对比文件1公开了一种应用于单双子叶植物的CRISPR/Cas9载体的构建方法。审查员认为:对比文件1公开了一种包含分别构建一或多个sgRNA表达盒的重组质粒和CRISPR/Cas9p重组质粒而后将二者分别酶切后连接获得应用于单双子叶植物的CRISPR/Cas9载体的方法,即权利要求1的发明构思和方法已经被对比文件1公开,二者的区别仅在于:权利要求1构建sgRNA中间质粒以及将靶序列与sgRNA表达盒连接的步骤与对比文件1略有不同,并对双元载体中间质粒和大肠杆菌菌株以及筛选培养基、鉴定引物等进行了替换。对于这一点,权利要求1对于sgRNA中间质粒的构建步骤以及将靶序列与sgRNA表达盒连接的步骤是基于本领域常规的酶切连接步骤获得的,与对比文件1并无本质上的差别,而对于其中酶切位点的选择属于本领域技术人员的常规设计,并且对于双元载体、菌株、引物等的替换也是本领域技术人员的常规选择,并且申请文件中并未记载权利要求1所构建的CRISPR/Cas9载体针对的靶基因序列以及对于靶基因的编辑效果,因此本申请的构建步骤未取得预料不到的技术效果。因此,权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求2-9直接或间接引用权利要求1,均属于常规选择,也不具备创造性。

2、复审理由

本申请发明人仔细阅读了第一次审查意见通知书和驳回决定,对权利要求书做出如下修改,并提出如下复审理由:

1)修改说明:

1)将原权利要求12合并后加以整理成新权利要求1

2)将原权利要求5拆分成两项从属权利要求;

3)将所有权利要求的编号重新整理,并更改其中的引用关系和与权利要求1的对应关系。

以上修改均未超出原说明书和权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

修改的权利要求详见权利要求书替换页。

2)权利要求1的创造性问题

首先,本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:1)权利要求1限定了CRISPR/Cas9载体的构建是基于pSGpCC基本载体进行构建;对比文件1则是基于pCAMBIA1300载体;2)本申请和对比文件1的构建过程完全不同。

其次,申请人拟从以下3个方面进行详细说明:

其一,尽管本申请和对比文件1都是为了研究一种应用于植物基因组编辑的CRISPR/Cas9载体。但是,本申请CRISPR/Cas9载体的构建是基于pSGpCC两种载体,而对比文件1是基于pCAMBIA1300载体。两者采用的是完全不相同的载体体系。并且对比文件1和现有技术也并未给出这两种载体可以交替应用于植物CRISPR/Cas9载体构建的技术方案或是技术启示。

其二,基于前述的其一,本申请和对比文件1对于植物CRISPR/Cas9载体构建的方法完全不同。本申请的构建方法包括3个步骤:1PSG载体的构建;2PCC载体的构建;3CRISPR/Cas9载体构建。在步骤1中,以pX330质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段,回收该片段,标记为sgRNA1,引物序列为SEQ ID NO.1所示的Sg1-FSEQ ID NO.2所示的Sg1-R;然后使用EcoRI-HFXbaI分别双酶切pUC19sgRNA1,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;再以pSG1质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增sgRNA片段,回收该片段,标记为sgRNA,引物序列为SEQ ID NO.3所示的Sg2-FSEQ ID NO.4所示的Sg2-R;使用EcoRI-HFXbaI双酶切pUC19,使用BsaI酶切sgRNA,回收目的片段后按17的摩尔比进行连接,得到重组质粒pSG,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。

在步骤2中,以pX330质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增hSpCas9片段,其中引物Cas-FCas-R1Cas-R2=1.50.21.3,回收该片段,标记为hSpCas9Cas-F的序列如SEQ ID NO.5所示,Cas-R1的序列如SEQ ID NO.6所示,Cas-R2的序列如SEQ ID NO.7所示;再使用NcoI-HFBstEII-HF分别双酶切pCAMBIA1302hSpCas9,回收目的片段后按15的摩尔比进行连接,得到重组质粒pCC1,测序,保留序列完全正确的阳性质粒;以pCAMBIA1302质粒为模板,使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增CaMV 35 enhanced promoter片段,回收该片段,标记为CaMV-ep,引物序列为SEQ ID NO.8所示的CaMV-ep-FSEQ ID NO.9所示的CaMV-ep-R;使用HindIIINcoI分别双酶切pCC1CaMV-ep,回收目的片段后按15的摩尔比进行连接,得到重组质粒pCC,测序,保留序列完全正确的阳性质粒。

在步骤3中,根据选定的靶序列,合成互补的Oligo DNA,将合成的Oligo DNA序列进行退火复性获得DNA双链序列,并稀释;采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体,酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收;配置连接体系,将S1获得的稀释后的DNA双链序列与S2获得的酶切产物进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中;重组质粒的鉴定和提取:分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中震荡培养,分别以M13 fwdOligo-R为引物进行菌液PCR鉴定,将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中,培养后进行质粒的提取,得到重组质粒;重组资料和PCC质粒的双酶切:将得到的重组质粒和PCC质粒进行双酶切,酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段;连接、转化和鉴定:配置连接体系,将S5获得的酶切回收目标片段进行连接反应,将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中,挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养,并进行菌液PCR鉴定,将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养,提取质粒,即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。

相比之下,对比文件1公开的CRISPR/Cas9载体体系参考了Cong等人于2013年公开的克隆和分析sgRNA表达盒的关键序列和限制性位点,采用pCAMBIA1300载体进行该体系构建,利用Omega-PCR克隆方法将Cas9p基因连接至PubiP35s启动子并整体连入中间质粒(pYLsgRNA-OsU3, -OsU6a, -OsU6b, -AtU3b, -AtU3d, -AtU6-1, -AtU6-29),再将表达盒克隆至pCAMBIA1300载体上。其中,pCAMBIA1300载体是采用Bsal切割序列以12sgRNA载体(线性形式)给出,包括另外4个载体(pYLsgRNA-OsU3/LacZpYLsgRNA-OsU6/LacZpYLsgRNA-AtU3b/LacZpYLsgRNA-AtU3d/LacZ),其具有额外的LacZ基因(198bp)作为克隆选择标记。该载体是由PubiP35s启动子驱动。U-F/gR-RPps/Pgs为引物,通过巢式PCR扩增了一个连接的sgRNA表达盒。PpsPgs是位置特异性引物,具有不同的Bsal切割位点用于金门连接(补充表2),或具有不同的重叠末端用于Gibson组装。而本申请在构建pSG载体是采用EcoRI-HFXbaI分别双酶切pUC19sgRNA1,之后扩增,EcoRI-HFXbaI双酶切pUC19BsaI酶切sgRNA并连接;构建pCC载体是采用NcoI-HFBstEII-HF分别双酶切pCAMBIA1302hSpCas9,之后扩增,HindIIINcoI分别双酶切pCC1CaMV-ep的片段并连接,最后利用pSG载体和pCC载体进行后续构建连接。显然,本申请在载体选择、酶切、后续处理、扩增、连接等过程和对比文件1均不相同。对比文件1也并未给出可以以pSGpCC两种载体替换pCAMBIA1300载体进行CRISPR/Cas9载体构建的技术构思。因此,本申请权利要求1的技术方案较比对比文件1是非显而易见的。

其三,本申请和对比文件1都获得了应用于植物的可进行基因编辑的CRISPR/Cas9载体。在审查指南第二部分第四章3.2.2节关于显著的进步的判断部分明确指出:(2)发明提供了一种技术构思不同的技术方案,其技术效果能够基本上达到现有技术的水平。那么,通常应当认为发明具有有益的技术效果,具有显著的进步。因此,本申请较比现有技术具有显著的进步。

综上,权利要求1请求保护的技术方案较比对比文件1结合公知常识具有突出的实质性特点,并获得了显著的技术效果,具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。

3)权利要求2-9的创造性问题

权利要求2-9是权利要求1的从属权利要求,在其引用的主权利要求具备创造性的前提下,从属权利要求2-9也具备创造性。

综上所述,本申请的权利要求1~9与对比文件1结合公知常识相比,是采用不同的方案进行的发明,且技术效果也不比对比文件1结合公知常识差。对比文件1的技术方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,并且本申请获得了与对比文件1相当的技术效果,因此,本申请与对比文件1结合公知常识相比具有突出的实质性特征和显著的技术进步,具备了专利法规定的创造性。

综上所述,申请人相信上述理由,克服了驳回决定中所指出的缺陷,请复审部门的审查员在以上的基础上重新对本申请进行审查。谢谢。