本发明提供一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法,包括以下步骤:(1)选取瘤胃腹囊处瘤胃组织,采用温度为4-8℃的灭菌水清洗;(2)将瘤胃上皮组织剥离后依次采用灭菌水、PBS溶液一和PBS溶液二清洗,清洗后剪碎并采用消化液多次消化;(3)将消化后的瘤胃上皮组织过滤并离心、洗涤,得到瘤胃上皮细胞团;(4)将瘤胃上皮细胞团采用完全培养基培养。本发明改进和优化了瘤胃上皮细胞分离培养技术,通过此方法可以获得纯度高、活力强、生长快的瘤胃上皮细胞,还可以有效降低瘤胃上皮细胞体外培养污染的可能性,并能培养时间缩短为2-3d开始贴壁,4-5d完成铺层,普遍在4天左右完成。