尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年03月09日发出的关于《一种金龙胆草染色体制片的方法》的第二次审查意见通知书,对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求1、4合并成新权利要求1;
将原权利要求5变成新权利要求4。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
修改后的权利要求详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)关于权利要求1的创造性
本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:1)权利要求1是针对金龙胆草染色体制片方法;对比文件1是针对小麦根尖染色体制片方法,两者属于不同的植物品种;2)本申请在具体制片过程和对比文件1不同。
首先,本申请保留在一审答复中的陈述意见。
其次,审查员在二审通知中进一步指出:1)对比文件1已经公开了小麦根尖染色体制片方法,而金龙胆草同属于植物,本领域技术人员有动机借鉴对比文件1根尖染色体的制片方法制备金龙胆草染色体制片。2)由于金龙胆草是双子叶纲菊科植物,有别于小麦、玉米,因此,本领域技术人员在借鉴对比文件1的方法时能够预见采集时间、解离用酶液等需要进行适应性的调整。3)预处理药剂的选择、固定前清洗、解离前清洗等都为本领域的常规技术手段和常规设计。因此,本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2得到该权利要求所要保护的技术方案是显而易见的。
对此,申请人有不同看法,理由如下:其一,植物染色体研究已经经过很长时间的发展,并非对比文件1首次提出,但很多植物受限于制片技术的限制最终出来的效果并不是很好,而压片法制作过程简单直接,即便失败也可以重复使用和操作,因而大多研究者还是倾向于使用这种方法制片。本申请为了突破这种常规,试图找寻金龙胆草新的染色体制作方法,而至今本领域未见有金龙胆草的其它制片方法。其二,金龙胆草是双子叶纲菊科植物有别于对比文件1的小麦和对比文件2的玉米,不同植物的根形态和根中纤维素果胶含量差异显著,且根尖分生组织细胞中生物钟以及其中的染色体结构、分布均存在显著差异。因此,本申请进行金龙胆草染色体制片的具体方法为:(1)于下午5点至7点之间采集金龙胆草幼苗根尖1cm,于3~5℃下用饱和对二氯苯浸泡幼苗根尖3~5h;(2)将浸泡好的根尖依次用90%乙醇、清水漂洗,再用卡诺氏液固定20~30h;(3)将固定好的根尖依次用90%乙醇、70%乙醇、清水漂洗,然后将漂洗好的根尖用酸液或酶液解离;其中,酸液为1mol/L
HCl溶液,酶液为质量含量为1.5%
纤维素酶和
0.5% 果胶酶的混合酶液;(4)解离完成后将根尖用70%的乙醇漂洗,之后研磨匀浆,离心后加入醋酸重悬根尖离散细胞,取悬浮液滴于载玻片中央;(5)待载玻片上的醋酸挥发后染色并镜检。对比文件1公开的小麦根尖染色体制片的方法具体步骤为:A)种子发根:将小麦种子放在垫有滤纸的培养民众,加足量蒸馏水,于室温、遮光条件下培养;待种子露白后,于4℃、遮光培养20-24小时;然后将培养皿置于22℃、遮光培养;B)预处理:当小麦种子根长至0.5-1.5cm时,剪取幼根放入浓度为2mM 8-羟基喹啉溶液中,于20-25℃、黑暗条件下,预处理2-4h;C)固定:以蒸馏水清洗与处理后的幼根,室温条件下,卡诺氏固定液固定48h;D)酶解:用蒸馏水清洗将固定后的幼根,以刀片切取1.5-2.5mm的根尖,放入酶解液中,37℃水浴酶解45min-1h后,再以蒸馏水室温处理5min;E)涂片:吸取一个根尖置于载玻片上,用吸水纸吸去根尖周围水分,加30ul
35%冰醋酸,用解剖针将根尖分生组织敲碎,再去掉大块组织残渣,置于40-45℃的电热台面上,用解剖针将根尖组织涂匀,在35%冰醋酸挥发完之前,用1-2ml卡诺氏固定液漂洗载玻片,于室温下凉干,即获得所述小麦根尖染色体制片。仔细比对本申请和对比文件1的技术方案,在对根尖采集、预处理、解离、解离完成后组织重悬过程上均存在较大区别。具体地:本申请在进行根尖处理时是于3~5℃下用饱和对二氯苯浸泡,而对比文件1是于室温、遮光条件下培养;待种子露白后,于4℃、遮光培养20-24小时;然后将培养皿置于22℃、遮光培养。而且对比文件1在采用8-羟基喹啉溶液处理是于20-25℃、黑暗条件下预处理2-4h。众所周知,根尖处理对染色体的提取起到至关重要的作用,对比文件1给出的技术启示是种子的预处理一要遮光,二是种子露白后先于低温处理再于室温处理。显然,根据该技术启示并不能显而易见地应用于本申请对于金龙胆草根尖处理的具体过程。至于公知常识《遗传育种学》公开了饱和对二氯苯、8-羟基喹啉属于常见的预处理药剂,其并未具体教导如何将饱和对二氯苯、8-羟基喹啉分别或是交替应用于小麦、金龙胆草等不同植物体系进而能够获得理想染色体制片的结果,本领域技术人员熟知的是不同的处理试剂在采用不同的方法针对不同的物种应用时所带来的结果可能完全不同,只有建立在具体的实验研究基础上才能获知。此外,本申请在酶解完成后的操作是漂洗之后研磨匀浆并离心后再加入醋酸重悬根尖离散细胞,并且限定了离心过程的控制参数,这种思路是基于醋酸重悬前在不破坏染色体的基础上尽可能离散根尖,而对比文件1的思路则是在冰醋酸中用解剖针将根尖分生组织敲碎,再去掉大块组织残渣,置于40-45℃的电热台面上,用解剖针将根尖组织涂匀。显然,本申请和对比文件1完全属于不同的技术构思。至于对比文件2,其公开的滴片法是:酶解完成后,用体积浓度为70%的酒精小心吹洗根尖分生区外表皮2-3次;向吹洗完成的根尖中加入酒精离心后将上清液倒去,如此反复离心清洗两次;在加入醋酸,用解剖针将根尖到捣碎。对比文件2的技术构思是酶解后用酒精反复清洗,然后加入醋酸再采用与对比文件1相同的方法进行分散。显然,对比文件2的技术构思也和本申请完全不同。申请人认为,在评价一套技术方案的创造性时,应当将其作为一个整体看待,而不能将各个技术特征分开来单独评述,毕竟一套完备的方案都是通过各个细节整体构成,彼此相辅相成,缺一不可,这也是审查指南中评判创造性的宗旨。因此,现有技术并未教导如何对金龙胆草的幼苗根尖进行处理、固定、解离并在不破坏染色体的基础上充分离散进而获得良好的染色体制片结果。而对比文件1结合对比文件2公开的技术内容也并不能对本申请构成显而易见的技术启示。本申请较比对比文件1结合公知常识具有突出的实质性特点。
其二,本申请的技术效果为:以滴片法代替传统的压片法,得到的金龙胆草根尖离散程度大,且获得清晰的染色体图。此外,本发明操作简单,并没有使用对比文件1中价格昂贵且毒性较大的8-羟基喹啉和对比文件2中操作复杂的一氧化二氮储气罐,对于其细胞遗传学的理论研究及育种实践具有重要意义。附图2-4还提供了金龙胆草根尖的镜检图,有放大100倍和放大400倍,可以看出染色体分散均匀且清晰,和以往的压片法相比效果显著。至于对比文件1和对比文件2的技术效果,由于属于不同的植物品种,彼此间不具有可比性。退一步地,即便审查员认为对比文件1也获得了清晰可见的染色体图。《专利审查指南》第二部分4章节的第 3.2.2小节中关于显著的进步的判断的规定:在评价发明是否具有显著的进步时,主要应当考虑发明是否具有有益的技术效果。以下情况,通常应当认为发明具有有益的技术效果,具有显著的进步: (2)发明提供了一种技术构思不同的技术方案,其技术效果能够基本上达到现有技术的水平。因此,本申请提供了另一种技术构思的金龙胆草染色体制片方法,较比对比文件1结合公知常识具有显著进步。
2)关于权利要求2-4的创造性
权利要求2-4为权利要求1的从属权利要求,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求2-4也具备创造性。
综上所述,本申请的权利要求1~4与对比文件1-2结合公知常识相比,是基于不同的技术问题、采用不同的方案进行的发明,且技术效果也有本质不同。对比文件1-2的综合方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~4的技术方案相较与对比文件1-2具有实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定的创造性。
如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷,请给申请人提供修改和陈述意见的机会,申请人将尽力配合审查员的工作,谢谢审查员。