尊敬的国家知识产权局:
申请人收到了国家知识产权局对申请号为201810076484.6发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动,申请人仔细阅读了审查意见通知书正文,按通知书的要求进行了修改,申请人提出以下意见,希望和审查员商榷:
一、修改说明:
1、将权利要求2中的技术特征加入到权利要求2中,形成新的权利要求2。
2、删除权利要求2,并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系。
以上修改没有超出原权利要求书和说明书的范围。详见修改后的权利要求书。
二、关于修改后的权利要求1的创造性
修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于:步骤(2)中的人工合成的含鸡TREM-B2核苷酸序列具体地是插入到pCD513B-1的EcoRI和BamHI酶切位点之间;所述的步骤(2)中将慢病毒包装质粒载体进行酶切的体系如下所示:1 μg/μl GV218 1.8-2.2 μl,10×NEB buffer 4.5-5.5 μl,100×BSA 0.4-0.6 μl,EcoRI 0.8-1.2 μl,BamHI 0.8-1.2 μl,余量为ddH2O,以上总体积为50 μl;所述的步骤(2)中将人工合成含TREM-B2核苷酸序列酶切的体系如下所示:80-100 ng/μl鸡TREM-B2
15-20 μl,10×NEB buffer 4-6 μl,100×BSA 0.4-0.6 μl,EcoRI
0.8-1.2 μl,BamHI 0.8-1.2 μl,余量为ddH2O,以上总体积为50 μl。
基于区别技术特征,由表9和图1可知,鸡肝癌细胞(LMH)TREM-B2过表达稳转株中TREM-B2 mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高78倍,TREM-B2过表达显著极显著。
综上,本发明宿主细胞为经过驯化的鸡肝癌细胞(LMH)系,此方法解决了鸡原代细胞较难培养、传代后不易贴壁培养等问题。本发明利用GFP荧光和嘌呤霉素共同筛选的TREM-B2重组蛋白转染鸡肝癌细胞 后提高了亚克隆的成功率,此方法解决了亚克隆假阳性发生率高和重组蛋白质的下游纯化过程。本发明TREM-B2过表达的鸡肝癌细胞(LMH)系较未转染鸡肝癌细胞TREM-B2表达量显著提高,此方法解决了一般肝脏细胞TREM-B2表达量低的问题,为TREM-B2的功能研究提高了技术支持平台。
审查员认为:对比文件1公开了一种TREM2过表达的的RA-FLS稳转细胞株,还公开了TREM-2过表达的的RA-FLS稳转细胞株的构建方法。对比文件2公开了鸡来源的TREM-B2的核苷酸序列。对比文件3公开了 TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化。本领域已知,TREM-2为在哺乳动物体内表达的髓样细胞触发受体,TREM-B2为家禽体内表达的髓样细胞触发受体,且TREM-B2和TREM-2具有一定的序列相似性,均为抑制型的髓样细胞触发受体。因此,在对比文件1的基础上,本领域技术人员有动机构建TREM-B2过表达稳转细胞株来研究TREM-B2对不同组织细胞的影响。且在对比文件3的基础上,本领域技术人员有动机研究过表达TREM2对人肝癌细胞系的影响及过表达TREM-B2对鸡肝癌细胞的影响。过表达TREM-B2的鸡肝癌细胞TREM-B2 mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高的技术效果是本领域技术人员能够合理预期的,具体的表达水平能够通过本领域的常规技术手段检测。
申请人不赞同以上观点。申请人认为:对比文件1中的 TREM-2为在哺乳动物体内表达的髓样细胞触发受体,本发明TREM-B2
为家禽体内表达的髓样细胞触发受体,首先两者的作用对象不同;其次“,TREM-2为在哺乳动物体内表达的髓样细胞触发受体”与“TREM-B2为家禽体内表达的髓样细胞触发受体”,虽然二者名字相近,功能相似,哺乳动物TREM-2与家禽TREM-B2氨基酸序列相似度最高,但也仅为43.6%。故此可以说,哺乳动物TREM2和家禽TREM-B2是两种完全不同的蛋白质,只是其在机体中所发挥的功能相近,均为抑制型的髓样细胞触发受体。第三,且对比文件1无法达到本申请的“鸡肝癌细胞(LMH)TREM-B2过表达稳转株中TREM-B2
mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高78倍”的技术效果。
对比文件 2(“Gallus gallus triggering receptor
expressed on myeloid cells B2 (TREM-B2), transcript variant 2,mRNA, Acession number:NM_001080868.1”,Viertlboeck
BC et al., GenBank,第1-2页,公开日:2017年1月4日)公开了鸡来源的TREM-B2的核苷酸序列。本申请首先确定了此TREM-B2 mRNA两端非编码区的酶切位点;因为公开了鸡来源的TREM-B2的核苷酸序列的非编码区很长,此酶切位点是申请中特别选定的,酶切效率高,且保留了TREM-B2所有编码氨基酸的信息。对比文件2没有公开鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的构建方法,因此,本申请相对于对比文件2具有突出的实质性特点。
对比文件3 (“TREM2 siRNA inhibits cell proliferation
of human liver cancer cell lines ", Sui-Liang Zhang et al.,Int J Clin Exp Pathol,第 9 卷 第4期,第4318-4328页,公开日:2016年4月15日)公开了TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化 (参见对比文件3摘要)。首先,如前所述,TREM-2为在哺乳动物体内表达的髓样细胞触发受体,TREM-B2为家禽体内表达的髓样细胞触发受体,虽然二者名字相近,功能相似;哺乳动物TREM-2与家禽TREM-B2氨基酸序列相似度最高,但也仅为43.6%。故此可以说,哺乳动物TREM2和家禽TREM-B2是两种完全不同的蛋白质,只是其在机体中所发挥的功能相近,均为抑制型的髓样细胞触发受体。第二,人和鸡鸡肝癌细胞在细胞生长曲线、传代能力及培养液组成等多方面存在明显差异;对比文件3中人TREM2 siRNA对家禽肝癌细胞系不一定起作用。第三,本申请是关于TREM-B2基因过表达稳转株的构建方法,对比文件3只是TREM2 siRNA暂时对人肝癌细胞的作用结果,不能形成稳定的传代细胞。因此,本申请相对于对比文件3具有突出的实质性特点,且对比文件3也没有达到本申请的“鸡肝癌细胞(LMH)TREM-B2过表达稳转株中TREM-B2 mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高78倍”的技术效果。
审查员认为:载体和目的基因双酶切酶切体系及连接体系均是本领域技术人员能够通过常规调整确定的。
申请人认为:首先,本申请人在鸡TREM-B2 mRNA两端众多个非编码区的酶切位点中选定了本申请中应用的酶切位点;针对选定的酶切位点本申请人选取了载体、内切酶及连接酶,这是一个针对性的酶切和连接系统,此系统的特殊性才保证了TREM-B2 mRNA在鸡肝癌细胞(LMH)中的高表达。
本申请人在现有技术中并没有给出“鸡肝癌细胞(LMH)TREM-B2过表达稳转株中TREM-B2
mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高78倍”的技术效果;其次,在生物技术的研究中,每一个工艺参数都有其自然属性,有时候因为一个参数选取的不同,就会带来不同的技术效果,因此,审查员应该从整体上把握技术方案,不能割裂来看;更不能通过事后判断就否定本申请人的创新,审查员所知晓的范围比一般技术人员广,因此,恳请审查员多列举证据来证明评判本发明的创造性。
因此,对比文件1-3均没有公开本申请的区别技术特征,也没有达到本申请的技术效果,且上述的区别技术特征也不是本领域的公知常识,因此,对比文件1-3和公知常识对修改后的权利要求1不具有技术启示。修改后的权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。
三、关于修改后权利要求2-3的创造性
在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,其从属权利要求2-3也必然具有创造性。
四、关于修改后权利要求4的创造性
修改后权利要求4与修改后的权利要求1具有单一性,在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,修改后权利要求4也必然具有创造性。
综上所述,本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。如有问题,望及时联系申请人或代理人,给予再次答复的机会, 联系电话:13551134124。
请审查员继续审查。
致礼
申请人:四川农业大学
2021年05月11日