尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年02月02日发出的关于《一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求1和3合并成新权利要求1;
删除原权利要求2;
将原权利要求10的主题改成“一种非诊断目的地基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒的使用方法”。
将其余权利要求依次变成权利要求2~8,并更改相应的引用关系。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
修改后的权利要求详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)权利要求1具有创造性
本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:本申请采用恒温隔绝式荧光PCR手段,对比文件1采用双重TaqMan荧光定量RT-PCR技术,两者的试剂盒组成以及引物结构不相同。
针对上述区别技术特征,审查员结合对比文件1、2和本领域常规技术手段驳斥了本申请的创造性,在审查意见中论述如下:
针对区别技术特征1),基因C型鸭甲肝病毒和牦牛轮状病毒均为RNA病毒,因此,本领域技术人员有动机借鉴对比文件2公开的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒来得到基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒。对比文件1公开了荧光定量PCR检测DHAV-3(即DHAV-C)的引物和探针,具体公开内容梦见上述对权利要求1的评述。即对比文件1公开了以VP3基因为靶基囚设计检测DHAN-3病毒的荧光定量PCR引物和探针。将本申请权利要求1所述引物及探针和对比文件1公开的内容进行比对,显示本申请的SEQ ID NO.1所示上游引物和对比文件1SEQ ID NO.10所示上游引物的前20个碱基完全相同,仅少了一个碱基(本申请的SEQ IDNO.1为20bp,对比文件1 SEQ ID NO.10为21bp),本中请的SEQ ID NO.3所示探针序列和对比文件ISEQ ID NO.12所示探针序列完全相同。且对比文件ISEQ IDNO.12所示探针52端连接有FAM标记,3端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。恒温隔绝式荧光PCR平台进行PCR检测的原理和传统荧光定量PCR的原理相同,只是PCR过程中温度控制的方式不同。因此,在设计基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测的引物和探针时,本领城技术人员有动机借鉴对比;文件1公开的荧光定量PCR引物和探针。且在对比文件1公开以VP3基因的基因序列及为靶基因设计检测DHAV-3病毒的基础上,本领域技术人员能够通过本领域常规技术手段设计上下游引物。针对区别技术特征2), 本领域技术人员能够根据实际检测效果优化试剂盒的反应体系,并对Taq酶、反转录酶、上下游引物、探针和dNTP的量进行常规调整。因此,在对比文件2的基础上,结合对比文件1和本领域常规技术手段得到权利要求3请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的,权利要求3不具备突出的实质性特点和显著的进步,不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对此,申请人有不同看法:
其一,从要解决的技术问题来看:本申请要解决的技术问题为:针对基因C型鸭甲肝病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的恒温隔绝式荧光PCR检测方法。尽管对比文件1也是针对血清1型鸭甲肝病毒和血清3型鸭甲肝病毒而提出的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,但对比文件1不能实现现场快速检测。因此,本申请解决了对比文件1不能解决的问题。对比文件2是要通过恒温隔绝式荧光PCR技术实现牦牛轮状病毒的快速检测,由于基因C型鸭甲肝病毒和牦牛轮状病毒完全属于两种不同的病毒,因而要解决的技术问题并不相同,不具有可比性。
其二,从技术方案出发,本申请的试剂盒包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1.5μL、反转录酶1.5μL、基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物各2.5μL、基因C型鸭甲肝病毒探针0.5μL、dNTPs 2.5μL;所述基因C型鸭甲肝病毒上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示;所述基因C型鸭甲肝病毒下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示;所述基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示;基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列的 5'端连接有 FAM 标记,3 '端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。对比文件1的试剂盒包括:PCR扩增缓冲液、DHAV-1和DHAV-3RNA模板作为阳性对照、RNase Free Water作为反应体系调整的基础补充液及空白对照、引物对和探针,其中引物对3和探针1用于检测1型鸭甲肝病毒VP0基因,引物对4和探针2用于检测3型鸭甲肝病毒VP3基因;引物对3核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示,探针1核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示;引物对4核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示;探针2核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
经比对,本申请SEQ ID NO:1所示上游引物和对比文件1 SEQ ID NO:10所示上游引物的前20个碱基完全相同,本申请SEQ ID NO:3所示探针序列和对比文件1 SEQ ID NO:12所示探针序列完全相同。根据引物和目的基因互补的原则,那么根据对比文件1的技术启示,本申请SEQ ID NO:2所示下游引物序列和对比文件1的SEQ ID NO:11所示下游引物序列在结构应该具有高度相似性,但实际上本申请SEQ ID NO:2所示下游引物和对比文件1 SEQ ID NO:11所示下游引物序列存在较大区别。显然,本申请是采用不同的设计构思得出的下游引物序列,尽管目前设计引物的软件是已知的,但对软件加以应用设计出合适的引物和探针则需要加入发明者的创造性思维,并付出创造性劳动。
进一步来看对比文件2的技术方案,对比文件2公开的是一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,尽管采用的检测技术也是恒温隔绝式荧光PCR,但牦牛轮状病毒和本申请的C型鸭甲肝病毒属于两种完全不相同且宿主亦不同的病毒,对比文件2给出的技术启示为如何采用恒温隔绝式荧光PCR来检测牦牛轮状病毒。因此,即便结合对比文件1、对比文件2和本领域常规技术手段,仍不能显而易见地得出本申请的技术方案。
其二,本发明获得了显著的进步,其技术效果总结如下:1)本发明的试剂盒特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳,可在现场快速检测。2)本发明能快速、准确地检测出被检样本中的基因C型鸭甲肝病毒RNA,可用于基因C型鸭甲肝病毒的分子流行病学调查。3)本发明的荧光定量PCR反应液中包括反转录酶和PCR扩增酶,使核酸的反转录和扩增在同一管中进行,简化了操作,节省了试剂同时闭管操作降低了RNA的降解和污染的可能性。4)荧光定量PCR反应液、阳性和阴性对照品均采用冻干方式制备,降低了试剂盒的保存条件,可4℃保存一年时间,便于运输,方便储存,同时提高了试剂的稳定性。本申请说明书具体实施例证明了本申请的试剂盒的最低检测限为3.85 copies/µL,以及特异性和稳定性良好,此外和普通荧光定量PCR相比检出率更高,同时又比现有PCR方法操作简单、便携,更适用于现场检测诊断。尽管对比文件1也通过双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测技术对鸭甲肝病毒有良好的检测效果,针对DHAV-1和DHAV-3的灵敏度分别为98拷贝和10拷贝。显然,本申请的技术效果至少不比对比文件1差。而对比文件2的技术效果为通过恒温隔绝式荧光PCR平台获得了牦牛轮状病毒的良好检测效果,与本申请不具有可比性。因此,本申请较比现有技术具有显著进步。
综上,权利要求1较比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步,具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。
2)权利要求2-8具有创造性
权利要求2-7是权利要求1的从属权利要求,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求2-7也具备创造性。
权利要求8保护的是一种非诊断目的地基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒的使用方法,是基于权利要求1-7的试剂盒实现,在权利要求1-7具备创造性的前提下,权利要求8也具备创造性
综上所述,本申请的权利要求1~8与对比文件1、2结合公知常识相比,是基于不同的技术构思、采用不同的方案进行的发明,且技术效果也比对比文件要好。对比文件1、2的综合方案不足以对本申请构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~8的技术方案相较与对比文件1具有实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定的创造性。
如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷,请给申请人提供修改和陈述意见的机会,申请人将尽力配合审查员的工作,谢谢审查员。