尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年03月26日发出的关于《一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛冠状病毒检测试剂盒及应用》的第二次审查意见通知书,对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将权利要求1中“权利要求1所述的”、“权利要求3或4所述的”的语句删除。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
修改后的权利要求详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)权利要求1具有创造性
本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:
1)本申请保护的是用于检测牦牛冠状病毒的试剂盒,并且是基于恒温隔绝式荧光PCR平台,对比文件1公开的是检测牛冠状病毒的引物和探针,采用的是基于TaqMan的实时荧光PCR平台。
2)本申请的试剂盒包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管,并限定了所包括的各组分及浓度,以及具体引物和探针的序列和标记基团等。
在二审通知书中,审查员进一步结合对比文件1-3驳斥了本申请的创造性,具体如下:对比文件2 (CN106868227A,20170620) 公开了基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及其应用,包括:上游 引物和下游引物和探针,其中,探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。引物和探针在制备检测试剂盒方面的应用。基于恒温隔绝式荧光PCR平台的检测试剂盒,包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、上游引物、下游引物各3.5μL和探针0.25μL、dNTPs4μ L。Taq
酶的终浓度为5U·μL",反转录酶的终浓度为20U·μL"上游引物和下游引物的终浓度均为10μ
mol. μL',探针的终浓度为10μ
mol. μL',dNTPs的终浓度为2.5mM。荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到:将Taq酶、反转录酶、上游引物、下游引物和探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50°C,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管,制得荧光定量PCR反应液冻干管。荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。反应缓冲液由以下组分构成: 500mM KCl、pH 8.3、 100mM Tris-HCl、15mM MgCl,余量为ddH2O,以上体积总量为3ml。阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将含有病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内,降至-50"C, 然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成;阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将无病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内,降至-50°C,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成。该试剂盒保存于4C下。种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的病毒检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤: 1)制备
RNA模板:取粪便样本上清液200μL,参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA,制备得到RNA模板; 2)荧光PCR反应体系的制备:荧光PCR反应体系的制备于冰上操作;取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合,制备得到阳性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5μL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阳性对照反应体系;取100μ L反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中,制备得到阴性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5μL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阴性对照反应体系;取50μL反应缓冲液和5μL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到检测样本RNA反应体系;然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中;加样时注意避光操作;将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s,避免出现气泡;3)扩增检测:把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内,按运行键,即开始反应: 4)检测结 果判定:“+”表示阳性,“_”表示阴性(参见权利要求1-10)。可见,虽然对比文件2所针对的具体病毒不同于本申请,但是其已经给出了针对牦牛的致病病毒可以采用上述具体方法的技术启示。
现有技术如对比文件3 (
Bovine coronavirus R-AH187, complete genome, EF424620.1, 30964bp RNA
linear,Zhang,X.等,《NCBI genbank》,第1-10
页, 20160723)公开了牛呼吸冠状病毒的全基因组序列,其中第195-13346个核酸编码阅读框ORFIa蛋白。经过比对可知,对比文件3中核苷酸序列第13182-13295
个核酸序列的反向互补序列与本申请SEQ
ID NO.4相同,对比文件3中核苷酸序列第13278-13295 个核酸序列的反向互补序列与本申请SEQ ID NO.1相同,对比文件3中核苷酸序列第13182-13199
个核酸序列与本申请SEQ ID NO.2相同,对比文件3中核苷酸序列第13252-13271个核酸序列的反向互补序列与本申请SEQIDNO.3相同。
在对比文件1公开内容的基础上,结合对比文件2所给出的技术启示,本领域技术人员容易想到针对牛尤其是牦牛的致病病毒如牦牛中的冠状病毒进行检测,采用对文件2中的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的方法。通过现有技术中如对比文件3公开的牛冠状病毒中编码阅读框的核苷酸序列,结合常用的商业化的引物.设计软件,采用常规技术手段即可通过扩增、测序确定我国商业养殖牦牛中的冠状病毒,进而通过有限的实验即可设计获得用于检测牦牛中冠状病毒的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的具体引物和探针及试剂盒。并且,基于引物和探针与牦牛中冠状病毒特异性结合的情况,因而可以预期能达到特异性检测牦牛中冠状病毒的技术效果。根据实际需要,各种反应组分的具体浓度根据实际情况,采用常规技术手段,本领域技术人员通过有限的实验即可确定。
因此,本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及常规技术手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的,权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步,不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对此,申请人有不同看法,理由如下:
其一,从要解决的技术问题出发,本申请旨在针对牦牛冠状病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法。对比文件1提供的是针对牛冠状病毒检测的基于TaqMan的实时RT-PCR分析技术。对比文件2要解决的是针对牦牛轮状病毒提供一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的检测试剂盒。申请人认为:牦牛虽然也属于牛科哺乳动物,但由于长期生活在高海拔地区,其在生活习性、体质特征、基因排布等方面与普通牛种均存在明显差异,而且冠状病毒在不同品种牛之间的基因排布、进化速度、是否存在变异以及变异情况等均为未知,需要展开细致研究。此外,冠状病毒和对比文件2的轮状病毒完全属于不同种类的病毒,彼此之间不具有关联性和/或相似性。显然,三者要解决的技术问题并不相同。
其二,从技术方案出发,本发明的检测试剂盒包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1.25μL、反转录酶1.5μL、牦牛冠状病毒上游引物、牦牛冠状病毒下游引物各3.0μL和牦牛冠状病毒探针0.3μL、dNTPs 3μL;所述Taq酶的终浓度为5U·μL-1,反转录酶的终浓度为20U·μL-1,牦牛冠状病毒上游引物和牦牛冠状病毒下游引物的终浓度均为10 μmol·μL-1,牦牛冠状病毒探针的终浓度为10 μmol·μL-1,dNTPs的终浓度为2.5 mM;所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到:将所述的Taq酶、反转录酶、牦牛冠状病毒上游引物、牦牛冠状病毒下游引物和牦牛冠状病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管,制得荧光定量PCR反应液冻干管;所述牦牛冠状病毒上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示;所述牦牛冠状病毒下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示;所述牦牛冠状病毒探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示;牦牛冠状病毒探针的核苷酸序列的 5'端连接有 FAM 标记,3 '端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。具体序列结构如下:
再来看对比文件1公开的内容,对比文件1公开的基于TaqMan的实时荧光PCR平台的检测引物和探针结构具体如下图:
显然,其采用的引物和探针序列与本申请完全不同,而对比文件1也并未公开或是启示如何对引物及探针结构进行调整、以及增加反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管进而获得可以针对牦牛冠状病毒检测、并且是基于恒温隔绝式荧光PCR平台的检测技术,因而其并不能对本申请构成显而易见地技术启示。
进一步看对比文件2公开的技术内容,对比文件2公开的试剂盒包括如下成分:对比文件2【0009-0011】本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;[0010]所述 荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶l山、反转录酶1.25uL、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物各3.5uL和牦牛轮状病毒探针0.25uLJdNTPs 4uL;牦牛轮状病毒
上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如ISEQ ID NO. 2所示;所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示;牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。
以及对比文件2的引物及探针序列如下:
显然,对比文件2给出的技术启示是如何设计针对牦牛轮状病毒的检测引物和探针,但轮状病毒和冠状病毒完全属于不同的病毒,具有不同的核苷酸,彼此之间不具有关联性,即便结合对比文件1和对比文件2也无法显而易见地得出权利要求1的技术方案。
进一步看对比文件3,其公开的是牛呼吸冠状病毒的全基因组序列,经比对,对比文件3中核苷酸序列第13182-13295个核酸序列的反向互补序列与本申请的牦牛冠状病毒序列相同。以及对比文件3中部分核苷酸序列与SEQ ID NO.1~3相同。牛冠状病毒和本申请的牦牛冠状病毒在核苷酸序列上部分互为反向互补序列也恰好证实了两者确实是存在不同之处。但毕竟牦牛冠状病毒还是属于冠状病毒,存在部分相同也属正常。两者之间的异同显然也只有在经过详细研究之后才能获知。进一步地,本申请的SEQ ID NO:1~3的序列结构与对比文件3公开的核酸序列存在部分反向互补,但这并不能说明本申请的引物和探针序列就是基于牛冠状病毒获得,对比文件3只是给出了牛呼吸冠状病毒的全基因组序列信息。而对比文件3也并未给出详尽的引物和探针设计手段。最主要的是,本申请的引物和探针,是先对从高原牦牛体内分离到的冠状病毒进行测序,在获得的基因序列的基础上进行引物和探针的设计,而对比文件3只是给出了普通牛的基因序列。因此,即便进一步结合对比文件1~3也仍然无法显而易见地得出本申请的技术方案。
其三,从应用的角度来说,无论是对比文件1的荧光PCR方法还是对比文件2的恒温隔绝荧光PCR技术都是技术上的进步,本申请将其应用到新的病原检测上去,都是对新技术的应用谱的拓展,也是新技术得以推广的前提。申请人是从该病原需要现场快速检测的需求的角度和技术问题出发申请本专利,并不是在对比文件1和2的启发下才进行本申请的相关研究。
其四,本申请较比两篇对比文件具有显著的技术效果。本申请的技术效果为:本申请的检测试剂盒特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳,可在现场快速检测。并且本发明能快速、准确地检测出牦牛冠状病毒RNA和普通牛冠状病毒RNA。显然,对比文件1不具备现场快速检测以及同时检测牦牛冠状病毒RNA和普通牛冠状病毒RNA的能力,对比文件2只能针对牦牛轮状病毒进行检测。因此,本申请较比对比文件1和2具有显著进步。
2)关于权利要求2~5的创造性
权利要求2~5为权利要求1的从属权利要求,在权利要求1具备创造性的前提下,其从属权利要求2~5也具备创造性。
综上所述,本申请的权利要求1~5与对比文件1~3结合公知常识相比,是基于不同的目的,采用不同的方案,依据不同的原理进行的发明,且技术效果也有本质不同。对比文件1~3的综合方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~5的技术方案相较与对比文件1~3具有实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定的创造性。
如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷,请给申请人提供修改和陈述意见的机会,申请人将尽力配合审查员的工作,谢谢审查员。