尊敬的审查员：

本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年05月14日发出的关于《一种3D培养猪乳腺上皮细胞的方法》的第二次审查意见通知书，对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述，申请人进行了认真的研读，并作出以下意见陈述。

意见陈述

1）权利要求1具有创造性

本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征：权利要求1限定的是猪乳腺上皮细胞的3D培养方法，并且具体限定了将孔板于37℃预热，并且将10代以前的猪乳腺上皮细胞用胰蛋白酶消化成单细胞后离心，还限定了离心转速和时间，以及将沉淀用Matrigel与Advanced DMEM/F12完全培养基按照体积比1:1于0~10℃配制的混合溶液重悬，按照30-40ul 每滴的量将重悬液滴入孔板，在孔板中加入Advanced DMEM/F12完全培养基继续培养2-3天，每隔一天更换一次Advanced DMEM/F12完全培养基。

针对上述区别技术特征，审查员在审查意见中认为：针对上述区别，对比文件1公开了以奶牛乳腺上皮细胞为对象，对传代培养的奶牛乳腺上皮细胞以基质胶Matrigel 进行三维培养，三维培养技术为本领域公知的培养方法，且适用于不同细胞，在此基础上，为对猪乳腺上皮细胞进行三维培养，本领域技术人员有动机利用对比文件1所述三维培养技术对猪乳腺上皮细胞进行培养。对比文件1公开了不同培养基对奶牛乳腺上皮细胞生长的影响:经过改良配制的DMEM/FI2融合了F12营养成分多样而DMEM营养浓度高的特点，可以满足许多不同类型细胞的生长需求:试验中采用乳腺上皮专用培养基进行奶牛乳腺上皮细胞的培养时，得到了纯度较高且细胞密度较大的细胞数量，但乳腺上皮专用培养基价格较为昂贵，而采用DMEMF12培养基，经过5代-7代纯化后也可得到纯度较高的奶牛乳腺上皮细胞，同时费用较前者低3倍-4倍(参见第12页第3.1节)。由此可见，对比文件I教导了采用DMEM/F12培养基对猪乳腺上皮细胞进行培养，基于该教导，本领域技术人员在对猪乳腺上皮细胞三维增养时可选择DMEMF12完全培养基(即生长培养基)，培养时间、培养基更换时间可常规调整确定。对比文件1公开了将Mrtrigel 加入孔板形成凝胶，再将乳腺上皮细胞悬液接种于孔板中，而作为一种常规调整，本领域技术人员可将细胞沉淀用Matrigel 与DMEMFI2完全培养基的混合溶液重悬后滴入孔板形成凝胶，Matrigel 与培养基的配比、温度、每孔滴加量可常规调整，而将孔板37C下预热、倒置平板培养，是本领域技术人员的常规技术操作。对比文件1公开了在奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化中，将消化好的单细胞悬液移入10mL锥底刻度离心管中，于128g离心8min, 使细胞沉淀，本领域技术人员可在此基础上对单细胞的离心转速及时间进行常规调整。

由此可见，在对比文件1的基础上结合本领域常规技术操作，得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。

对此，申请人有不同看法，理由如下：

其一，从要解决的技术问题来看：本申请针对现有利用3D培养技术研究猪乳腺上皮细胞泌乳功能的空白，提供一种3D培养猪乳腺上皮细胞的方法。而对比文件1则是对奶牛乳腺上皮细胞的三维培养的形态观察。一方面，猪和牛属于不同的物种，猪是单胃动物，而牛属于反刍动物；另一方面，牛的乳腺较少可以集中存储大量的乳汁，而猪的乳腺为10对，产奶量较少而且不能在乳腺中存储，因而两者的乳腺上皮细胞具有不同的特有生理功能和形态结构，增殖速度也不同。因此，两者要解决的技术问题并不相同。

其二，从技术方案出发，本申请进行猪乳腺上皮细胞3D培养的技术构思为：将10代以前的猪乳腺上皮细胞用胰蛋白酶消化成单细胞，然后采用Matrigel与Advanced DMEM/F12完全培养基按照体积比1:1于0~10℃配制的混合溶液进行接种，之后再加入Advanced DMEM/F12完全培养基继续培养2-3天。而对比文件1进行奶牛乳腺上皮细胞3D培养的构思为：对奶牛乳腺上皮细胞进行原代培养，分离纯化后用生长培养基接种，培养2代的细胞进行后续3D培养，并且直接采用Matrigel制备胶原，之后采用专用培养基消化，然后Matrigel接种，之后采用DMEM/F12培养基和乳腺上皮专用培养基分别培养，培养时间是16天。显然，对比文件1的3D培养过程较比本申请要更为复杂，并且培养时间要比本申请也更长。尽管，对比文件1公开了模拟细胞体内生存状态的三维细胞培养技术成为今后细胞培养技术发展的必然趋势，三维培养是本领域公知的细胞培养技术，但现有技术并未教导如何将对比文件1的技术方案进行调整并应用于猪乳腺上皮细胞，最终还能成功培养出3D猪乳腺上皮细胞。对比文件1教导的是如何对奶牛乳腺上皮细胞进行3D培养，猪和牛完全属于不同的物种，两者的乳腺上皮细胞具有不同的特有生理功能和形态结构，增殖速度也不同，因而本领域技术人员没有动机将对比文件1的研究内容应用于猪乳腺上皮细胞的培养研究。如果牛乳腺上皮细胞能够对猪乳腺上皮细胞构成技术启示，那么牛乳腺上皮细胞也同样能对马/羊/骆驼/水牛等哺乳纲偶蹄目动物的乳腺上皮细胞构成技术启示，这样并不符合科学逻辑。此外，审查员还提及将细胞沉淀用Matrigel与DMEM/F12完全培养基的混合溶液重悬形成凝胶、Matrigel与培养基的配比、温度等过程及参数是本领域技术人员的常规技术手段。但是，现有技术同样并没有教导如何将前述的这些培养过程、参数与对比文件1中部分技术内容进行结合并且还要同时增加和/或去掉与本申请不同的步骤以及参数的技术内容，从而形成本申请权利要求1的材料方案，并实现本申请的技术效果。审查意见中将本申请权利要求1中区别于对比文件1的内容单独孤立地评述，不符合创造性判定原则。也可以合理的认为：审查意见的观点是在基于知晓本申请的发明目的、技术方案和效果之后，受本申请整体发明构思的启示而去有针对性将对比文件和常规技术进行结合，这不符合上述审查指南内容的精神。因此，申请人认为，对比文件1的技术方案结合常规技术操作不能构成对本申请显而易见的技术启示。

其三，本申请获得了显著的进步，技术效果如下：首次采用3D包被技术构建猪乳腺上皮细胞的培养技术，不同于以往的在基质表面进行3D培养细胞，本申请方法可以使得基质和细胞充分接触，更加符合体内微环境，且操作更为省时简便（具体实施例给出了培养获得的3D猪乳腺上皮细胞状态图，为三维球状结构）。退一步地，对比文件1也成功获得了奶牛三维乳腺上皮细胞，由于两者属于不同的物种，不具有可比性。因此，本申请较比现有技术获得了显著进步。

综上，权利要求1较比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。

2）关于权利要求2的创造性

权利要求2是权利要求1的从属权利要求，在权利要求1具备创造性的前提下，权利要求2也具备创造性。

综上所述，本申请的权利要求1~2与对比文件1结合公知常识相比，是基于不同的技术问题、采用不同的方案进行的发明，且技术效果也有本质不同。对比文件1的技术方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示，也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~2的技术方案相较与对比文件1具有实质性特征和显著性进步，具备专利法22条3款所规定的创造性。

如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷，请给申请人提供修改和陈述意见的机会，代理人电话：13551134124/028-85961062。

申请人将尽力配合审查员的工作，谢谢审查员。