尊敬的审查员:

您好!针对国家知识产权局于2021年05月08日发出的关于《基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牛传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒及应用》的驳回决定,申请人进行了认真的研读和分析,拟提出以下修改和复审理由。

1、审查员对本申请的驳回理由

审查员结合对比文件1和本领域普通技术知识和常规技术手段,评述了本申请权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性,具体如下:

审查员在审查意见中指出“权利要求1与对比文件1相比,区别特征在于: (1)对比文件1公开牛IBRV保守基因gB的TaqMan检测方法和检测试剂,权利要求I请求保护试剂盒,试剂盒包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管,限定荧光定量PCR反应液冻干管中包含的试剂、含量和试剂的终浓度以及荧光定量PCR反应液冻干管和阴性和阳性对照品冻干管的具体制备方法,井限定试剂盒是基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒:(2)引物和探针的序列不同,探针3"端连接的荧光淬灭基团不同。基于上述区别技术特征,权利要求1实际解决的技术问题是:提供一种便于使用的牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量PCR检测产品。针对上述区别技术特征(1),为了使用的便捷和商业应用等目的将检测试剂形成试剂盒、为了检测结果的准确在荧光检测中添加阳性对照对本领域技术人员来说是常规手段,同时本领域技术人员也能常规将检测用的引物、探针、dNTPs 和酶制备成荧光定量PCR反应液,并选用含有待检测对象的核酸片段(牛传染性鼻气管炎病毒DNA片段)的样品作为阳性对照品,不含待测对象的核酸片段的样品作为阴性对照品。同时,本领域技术人员也可以根据需要选择将荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品进行冻F从而方便储存,并有能力根据正交、单因素等常规实验手段确定加入到试剂盒中PCR反应体系各组分的用量和终浓度。本领域技术人员通常会将各个试剂加入到冻干管中降温加压冻干直至形成干粉后闭管从而得到冻干管,且本领域技术人员可以根据冻干效果的反馈通过有限的试验调整并选择合适的冻干温度、气压和时间,权利要求1中具体限定的组分的用量和终浓度、冻千温度、气压和时间是本领域技术人员常规选择的结果。权利要求1用基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牛传染性鼻气管炎病毒的用途限定试剂盒,但本领域技术人员同样能够预期TaqMan检测中各组分形成的试剂盒能够用于基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牛传染性鼻气管炎病毒检测中,因此该限定并未隐含权利要求1中的试剂盒的结构和/或组成的任何改变。针对上述区别技术特征(2),在对比文件1公开针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因作为靶基因进行病毒检测的情况下,荧光定量PCR检测是本领域常见的分子检测手段,在靶基因公开的情况下,针对靶标基因设计相应的引物和探针是本领域的常规技术手段,权利要求1中的引物和探针序列是本领域技术人员有限的实验和常规选择的结果,其技术效果也能经常规的实验进行验证。同时,TAMRA和BHQ1都为本领域常用的荧光淬灭基团,本领域技术人员可以进行常规选择。”

申请人根据上述论述对权利要求做出如下修改:

2、修改说明

将原权利要求1和2合并成新权利要求1;

将剩余权利要求依次变成权利要求2和3。

以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

修改后的权利要求详见权利要求书替换页。

2、复审理由

1)权利要求1具有创造性

权利要求1具备专利法第二十二条第三款规定的创造性,与对比文件1的区别技术特征在于:1)本申请限定了基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牛传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管,并限定了荧光定量PCR反应液冻干管的具体组成和制备方法;2)引物和探针序列不同。

针对上述区别技术特征,申请人拟从以下三个方面进行理由陈述:其一,本申请可以解决对比文件1不能解决的技术问题:针对现有普通的荧光定量PCR方法存在的需要大型设备、操作复杂、反应时间长、不能现场快速检测等问题,本申请基于恒温隔绝式荧光PCR技术建立了一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测试剂盒,而对比文件1则属于本申请背景技术中介绍的现有普通荧光定量PCR技术。因此,本申请解决了对比文件1存在的需要大型设备、操作复杂、反应时间长、不能现场快速检测等技术问题。

其二,本申请的技术构思和技术方案与对比文件1不同。为了解决前述的技术问题,本申请采用恒温隔绝式荧光PCR技术来设计牛传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒,对比文件1则采用的是实时荧光定量PCR检测技术。恒温热隔绝式PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)就是采用Rayleigh-Be′nard自然对流原理,利用仪器底部单一热源对特殊聚碳酸酯毛细反应管底部的紫铜圈接触加热,毛细管上部置入隔热挡板,上下的温度差从而使毛细管内部流体对流自发形成可供PCR扩增反应的连续的温度梯度,LED屏上直接显示检测结果,具有操作简便、快速高效、特异性强、仪器成本低等优点,30min~1h内便可出结果,仪器成本大概在上千元。但是由于iiPCR的高敏感性,其所需引物特异性较高,因而iiPCR引物设计要求较高,而且引物及探针的设计长度还要尽可能短。这也是阻碍恒温隔绝式荧光PCR技术在很多方面推广的主要原因。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。对比文件1采用的是TaqMan探针法,其技术原理是:将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。显然,恒温热隔绝式PCR和实时荧光定量PCR的TaqMan探针法属于完全两种不同的检测方法。本申请和对比文件1是基于不同的发明构思。

再进一步来看技术方案:基于不同的PCR技术,本申请的检测试剂盒中包括的反应体系组成与对比文件1势必存在较大区别。最重要的一点是,本申请的牛传染性鼻气管炎病毒上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示:gcacgggcac ctctgt;下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示:cccgtaaaag ggcgac;探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示:ctcggtgtac ccgtacgact cg;牛传染性鼻气管炎病毒探针的核苷酸序列的 5'端连接有6- FAM 标记,3 '端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。而对比文件1针对gB和gE基因采用的实时荧光定量PCR引物和探针如下:

显然,对比文件1公开的引物/探针序列与本申请的引物/探针序列存在较大区别,而对比文件1并未教导或启示在面对牛传染性鼻气管炎病毒的检测问题时,可以基于恒温隔绝式荧光PCR技术进行引物、探针序列开发的技术构思,并且也并未教导或启示对引物/探针进行何种调整(长度、位置等信息)以形成适用恒温隔绝式荧光PCR技术的牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒。此外,现有技术中也未见有采用恒温隔绝式荧光PCR技术成功检测牛传染性鼻气管炎病毒的报道。所以,基于对比文件1公开的内容,本领域技术人员没有动机得出针对牛传染性鼻气管炎病毒检测的引物/探针序列的具体调整方案以及无法预期采用哪种检测手段能获得较好的检测结果。而如果面对需要检测牛传染性鼻气管炎病毒的技术问题时,研究人员利用基因分析软件进行引物设计,对引物长度、位置进行调整,并参考引物及探针设计所应遵循的基本原则、对检测特异性的要求等理论知识,最终得出合适的新的引物序列和检测方法(即本申请技术方案的形成过程),这个过程本身属于一种典型的创新研究行为,至于引物应用的效果只有通过实际检测过程获知,而无法预期。

第三,本申请获得了显著的进步,其技术效果总结如下:本申请的检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳,可在现场快速检测的优点,能快速、准确地检测出被检样本中的普通牛传染性鼻气管炎病毒DNA,同时也可以检出牦牛传染性鼻气管炎病毒的DNA,可于4℃保存一年时间,便于运输,方便储存,同时提高了试剂的稳定性。此外,在本申请说明书具体实施例中证实了:1)本试剂盒的最低检测限为2.22copies/µL;2)对20份牛传染性鼻气管炎病毒阳性样本、10份阴性样本以及6种相关病原牛冠状病毒、牛副流感三型、牛合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病毒、牛轮状病毒、牛支原体进行检测,并设立牛传染性鼻气管炎病毒阳性标准品作为对照,结果显示对20份牛传染性鼻气管炎病毒阳性核酸样本的检测为阳性,10份阴性样本、和6种相关病原检测结果为阴性,证明该试剂盒特异性好;3)对牛传染性鼻气管炎病毒的8个稀释度的阳性标准品分别检测3次,以评价该试剂盒的稳定性,结果显示3次检测结果一致,表明试剂盒的稳定性良好;4)用本发明试剂盒和Pawar等(Pawar SS, Meshram CD1,Singh NK,et al.EvaGreen-based Multiplex Real-time PCR Assay for Rapid Differentiation of Wild-Type and Glycoprotein E-Deleted Bovine Herpesvirus-1 Strains[J].Anim Biotechnol,2017,28(4):248-252.)报道的荧光定量PCR方法对提取的20份牛传染性鼻气管炎病毒阳性样本和10份阴性样本核酸进行检测,比较两种PCR方法的符合率。结果显示20份牛传染性鼻气管炎病毒阳性样本中,本发明试剂盒检出的阳性样本数为20个,符合率为100%;而Pawar等报道的荧光定量PCR方法对总DNA检出的阳性样本数为15个,符合率为75%。两种方法对10份阴性样本检出结果均为阴性,符合率为100%。将荧光定量PCR未检出的而试剂盒检出为阳性的PCR产物测序,测序结果证实为牛传染性鼻气管炎病毒GB基因的特异序列。相比之下,对比文件1在检测特异性上是采用PRV、MDV、DPV和MDBK这些与牛传染性鼻气管炎病毒差异较大的病毒(本申请是对20份牛传染性鼻气管炎病毒阳性样本、10份阴性样本以及6种相关病原牛冠状病毒、牛副流感三型、牛合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病毒、牛轮状病毒、牛支原体进行检测)。对比文件1的灵敏度为0.02TCID50(本试剂盒的最低检测限为2.22copies/µL)。显然综合来看,本申请的技术效果优于对比文件1。因此,本申请较比现有技术获得了显著的进步。

因此,权利要求1请求保护的技术方案较比对比文件1结合公知常识具有突出的实质性特点,并获得了显著的技术效果,具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。

综上所述,申请人相信上述理由,克服了驳回决定中所指出的缺陷,请复审部门的审查员在以上的基础上重新对本申请进行审查。谢谢。