一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗口腔肿瘤技术领域,尤其涉及一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料及其应用。 

背景技术

[0002] 目前:口腔肿瘤是常见的十大癌症之一,严重影响患者进食、咀嚼、言语、美观,严重影响患者生存质量、危及生命。其中,口腔鳞状细胞癌发病率最高,超过90%的口腔恶性肿瘤为鳞癌。近年来口腔鳞癌的防治受到广泛研究。然而复发率高,其五年生存率仅为60%左右。口腔鳞癌的治疗以多模式联合治疗为主,由手术切除联合放化疗或生物制剂综合治疗。肿瘤化疗是重要的联合治疗手段,广泛应用于肿瘤防治研究,然而当肿瘤负荷过大或其本身对化疗药物不敏感、存在耐受性时,化疗药物效力有限;且化疗药物全身副作用大、局部效用低,对患者本身基础状况有一定要求,若患者自身状况较差,重要器官如心、肝脏、肾、肺等功能不全时,患者对化疗药物承受力较差。以上诸多原因限制了化疗疗效。近年来新型口腔抗癌材料及药物研发受到广泛关注。根据国家“十三五”生物产业发展规划,新型抗肿瘤材料研发、探索创新精准医疗防治模式成为国家生物产业重要战略方向。

[0003] 肿瘤微环境是肿瘤细胞生存的场所,其理化性质与人体正常内环境存在诸多不同,尤其是肿瘤的低pHpH失衡可促进肿瘤细胞增殖、存活和转移,与肿瘤的发展密切相关。在正常内环境中,胞内pH7.05~7.2,胞外pH约为7.4,即胞外>胞内。肿瘤细胞由于其增殖产生的有毒废物以及高糖酵解产生大量H+。而肿瘤细胞膜上存在多种离子交换体,如V-ATPases,可将H+运输到细胞外,造成胞外酸性微环境,呈“反向” pH梯度趋势,即胞内>胞外,胞外pH6.7~7.1,胞内pH:>7.2。酸性微环境参与到了口腔鳞癌的发展:与胞外H+产生及酸性微环境形成相关的跨膜蛋白CAIX的高表达与口腔鳞癌患者的低预后以及淋巴结转移相关;使用V-ATPases拮抗剂,阻止胞内H+转移到胞外,可诱导口腔鳞癌细胞凋亡和抗肿瘤。根据肿瘤微环境的低pH特性,设计pH敏感的抗口腔鳞癌智能材料是一个新的突破点。

[0004] 通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:现有抗口腔肿瘤的药物全身副作用大、局部效用低。

[0005] 解决以上问题及缺陷的难度为:

现有的抗口腔肿瘤化疗药物全身副作用大,局部效用低,没有针对肿瘤特定的微环境作出响应。

[0006] 解决以上问题及缺陷的意义为:发明能根据口腔肿瘤酸性微环境作出响应进而杀肿瘤的材料,提高局部效用,减少全身副作用带给患者的痛苦。

发明内容

[0007] 针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料及其应用。

[0008] 本发明是这样实现的,一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料,所述抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料为一种叔铵单体;

所述叔铵单体为甲基丙烯酸甲基十二烷基胺基乙酯即DMAEM,分子式为C19H37NO2,具体制备流程为:

1-溴代十二烷(25g, 100 mmol)加入80 mL 2-甲基乙醇胺(32g, 500mmol)异丙醇溶液中,室温下混合均匀。将该反应液在85℃下持续搅拌,回流8~10 小时后冷却至室温。随后将乙醚缓慢倒入,将反应体系稀释为150mL。用去离子水(150mL)和饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤,重复3次后收集有机相。使用无水硫酸钠干燥并真空浓缩,得到无色油状物二甲胺基十二烷基醇(24g, 99%)。将得到的二甲胺基十二烷基醇与31.8mL甲基丙烯酸甲酯混合,在室温下搅拌均匀。催化剂CAA0.4mol%)、阻聚剂对羟基苯甲醚 2mol%)同时加入反应体系中,同样在室温下混匀。将反应体系置于100~110℃下,反应期间持续搅拌,反应12h再补充加入催化剂CAA0.6mol%),继续保持持续搅拌,反应12h后恢复到室温,通过旋转蒸发法去除溶剂,使用硅胶柱层析法层析得甲基丙烯酸甲基十二烷基胺基乙酯(DMAEM, 4.2g, 14 %),为黄色透明油状物。

[0009] 进一步,所述抗口腔肿瘤的智能材料具有明显的pH敏感特性。

[0010] 本发明的另一目的在于提供一种所述抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料在制备抑制口腔鳞癌细胞生长的药物中的应用。

[0011] 本发明的另一目的在于提供一种所述抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料在制备抑制口腔鳞癌细胞引起的瘤生长的药物中的应用。

[0012] 本发明的另一目的在于提供一种所述抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料在制备预防或治疗口腔鳞癌的药物中的应用。

[0013] 进一步,所述应用包括:所述抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料在制备抑制口腔鳞癌细胞生长、抑制口腔鳞癌细胞引起的瘤生长、预防或治疗口腔鳞癌的药物中的安全浓度为:40 μg/mL

[0014] 结合上述的所有技术方案,本发明所具备的优点及积极效果为: 本发明可对口腔鳞癌酸性微环境作出响应进而杀肿瘤,局部效应高;中性环境下对口腔正常细胞(人口腔角质上皮细胞)无明显细胞毒性,生物安全性好;由于其局部使用,全身副作用小。

[0015] 本发明提供了一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料。本发明的材料在生物安全浓度下,可抑制肿瘤口腔鳞癌细胞增殖,促进口腔鳞癌凋亡;且具备pH敏感性质,在酸性环境(pH 6.7)下,其抑制增殖以及促进凋亡的作用增强。通过动物实验,也证明了材料具备抗肿瘤性能。 

附图说明

[0016] 1是本发明实施例提供的叔铵生物安全性检测示意图。

[0017] 2是本发明实施例提供的叔铵在不同pH下对口腔鳞癌细胞增殖作用检测示意图。

[0018] 3是本发明实施例提供的叔铵在不同pH下对口腔鳞癌细胞凋亡作用检测示意图。

[0019] 4是本发明实施例提供的叔铵对皮下鳞癌生长作用检测示意图。

[0020]  

具体实施方式

[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

[0022] 针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料及其应用,下面结合附图对本发明作详细的描述。

[0023] 本发明实施例提供的抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料为一种叔铵单体;本发明实施例提供的叔铵单体为甲基丙烯酸甲基十二烷基胺基乙酯即DMAEM

[0024] 本发明实施例提供的抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料具有明显的pH敏感特性。

[0025] 本发明实施例提供的抗口腔肿瘤的pH敏感智能材料在制备抑制口腔鳞癌细胞生长、抑制口腔鳞癌细胞引起的瘤生长、预防或治疗口腔鳞癌的药物中的安全浓度为:40 μg/mL

[0026] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0027] 实施例1

本发明用到的pH敏感智能材料为一种叔铵单体,甲基丙烯酸甲基十二烷基胺基乙酯(DMAEM)。

[0028] 一、叔铵的生物安全性检测

该部分使用的细胞是人口腔角质上皮细胞(Human Oral KeratinocytesHOK),培养在DMEM高糖培养基(Dulbeccos modified Eagle Medium,gibco)中。根据叔铵对HOK细胞生长的影响,评估该材料的生物安全性。

[0029] 96孔板里,接种1x104HOK细胞,于5% CO2细胞培养箱、37℃过夜孵育。细胞贴壁后,吸去原培养基,加入100 μL新鲜含不同浓度叔铵(0~100 μg/mL)的DMEM培养基,在37℃细胞培养箱孵育。每组6个复孔。

[0030] 24 h后,利用CCK8试剂盒(APExBIO)进行细胞增殖毒性检测。具体操作步骤为:吸去原培养基,PBS洗三遍,加入100 μL10% CCK8试剂的DMEM培养基,37℃细胞培养箱内避光孵育。1~2 h后,吸取上清转移到新的96孔板,在酶标仪下读取A450的光吸收值,并计算相对于Control组的细胞存活率。

[0031] 结果如图1所示,40 μg/mL的叔胺为安全浓度。

[0032] 二、叔铵对口腔鳞癌细胞增殖作用检测

该部分使用的是人舌鳞癌细胞系Cal-27细胞,培养在DMEM高糖培养基中。

[0033] 96孔板里,接种1x104Cal-27细胞,于37℃细胞培养箱过夜孵育。细胞贴壁后,吸去原培养基,加入100 μL新鲜含不同浓度叔铵(0103040 μg/mL)的DMEM培养基,培养基pH分别调整为7.36.7,在细胞培养箱孵育。每组6个复孔。

[0034] 24 h后,利用CCK8试剂盒进行细胞增殖检测。具体操作步骤为:吸去原培养基,PBS洗三遍,加入100 μL10% CCK8试剂的DMEM培养基,37℃细胞培养箱内避光孵育。1~2 h后,吸取上清转移到新的96孔板,在酶标仪下读取A450的光吸收值,并计算相对于Control组的细胞存活率。

[0035] 结果如图2所示,40 μg/mL的叔铵在中性(pH 7.3)环境下,有轻微抑制口腔鳞癌细胞增殖的作用(P0.05);酸性(pH 6.7)环境下,其肿瘤抑制作用显著增强(P0.001),提示该材料抑制肿瘤作用具有pH敏感性。

[0036] 三、叔铵对口腔鳞癌细胞凋亡作用检测

16孔板里,接种3x105Cal-27细胞,于37℃细胞培养箱过夜孵育。细胞贴壁后,吸去原培养基,加入1.5 mL新鲜含叔铵(040 μg/mL)的DMEM培养基,培养基pH分别调整为7.36.7,在细胞培养箱孵育。每组3个复孔。

[0037] 24 h后,利用细胞凋亡试剂盒(Annexin V FITC/PIdojindo)进行细胞凋亡检测。具体操作步骤为:

1)收集上清及孔板底部的细胞,调整细胞浓度为1x106/mL1xAnnexin V Binding Buffer中。

[0038] 2)吸去步骤(1)中制备的细胞悬液,加入到一个新的流式管中。

[0039] 3)向细胞悬液中加入5 μL Annexin V FITC结合物,再加入5 μL PI solution,室温下避光孵育15 min

[0040] 4)加入400 μL 1xAnnexin V Binding Buffer,于流式细胞仪Millipore Guava下进行检测。

[0041] 结果如图3所示,40 μg/mL的叔铵在中性环境下,可促进口腔鳞癌细胞凋亡;酸性环境下,其促凋亡作用增强,提示该材料促进肿瘤细胞凋亡作用具有pH敏感性。

[0042] 四、叔胺对皮下口腔鳞癌体内生长作用检测

5-6周雌性Balb/c裸鼠,皮下接种5x106Cal-27细胞,随机分为两组,每组4只。一周后,皮下瘤体形成。瘤体周围分别注射12.5 mg叔胺单体(溶于50 uL PBS),对照组注射等体积PBS,每周三次。分别于处理第8天、第16天处死小鼠,取下瘤体,记录瘤体体积大小。

[0043] 结果如图4所示,第8天时,叔铵稍抑制了口腔鳞癌生长,但差异不具备统计学意义(P0.05);第16天时,叔胺显著抑制了口腔鳞癌生长,差异具备统计学意义(P0.01)。提示叔胺能够抑制体内口腔鳞癌的生长。

[0044] 以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。