1. 一种快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,所述快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒,包括一组基于ZIP家族的检测引物以及内参引物。
2. 如权利要求1所述的快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,所述基于ZIP家族的检测引物,包括特异性引物ZIP1和特异性引物ZIP2;其中,所述特异性引物ZIP1的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示,所述特异性引物ZIP2的核苷酸序列SEQ ID NO:2所示;所述内参引物的核苷酸序列SEQ ID NO:3所示。
3. 一种如权利要求1~2任意一项所述的快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用,其特征在于,所述快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用方法为:
以天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取待测样品的基因组RNA,逆转录为cDNA为模板,使用试剂盒中的ZIP基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应,以正常样品为对照,按照2^(-ΔΔCt)计算相对丰度,得到基因的相对表达量;根据AcZIP家族的相对表达量,若ZIP1在叶片中和根中的表达量没有显著差异,而ZIP2在新叶中表达量急剧下降,在根中没有明显变化,则说明植株受到缺铁胁迫;其中,所述样品包括槟榔叶片和槟榔主根。
4. 一种应用如权利要求1~2任意一项所述的快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法包括以下步骤:
步骤一,实验基地进行槟榔缺铁处理:以Hoagland为配方,采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁处理;
步骤二,样品采集:对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集,用75%的乙醇擦拭干净,用液氮冻干;
步骤三,ZIP家族分析:根据已有的植物ZIP基因设计引物进行PCR扩增,两组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2;
步骤四,引物设计:根据ZIP基因的序列,应用primer5软件设计每个基因的特异性引物;
步骤五,引物的特异性验证:以提取的正常样品的cDNA为模板,进行PCR扩增,测序,与核酸序列进行比较,检测该引物的特异性;
步骤六,实时荧光定量PCR:采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测以及熔解曲线分析,再一次验证扩增的特异性。
5. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤一中,所述实验基地进行槟榔缺铁处理,包括:
在实验基地以Hoagland为配方,采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁处理,每隔一周时间进行培养液的更换,直到槟榔幼苗出现明显的表型;其中,缺铁的槟榔幼苗的新叶出现叶片全部黄化。
6. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤二中,所述样品的采集,包括:
对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集,用75%的乙醇擦拭干净,用液氮冻干,用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA, cDNA合成根据反转录试剂盒操作进行,-20℃冻存。
7. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤五中,所述引物的特异性验证,包括:
以提取的正常样品的cDNA为模板,进行PCR扩增,扩增的目的条带的大小分别为229bp和100bp;回收PCR产物,连接T载,进行测序,与ZIP1和ZIP2的核酸序列进行比较,以检测该引物的特异性;
其中,所述ZIP1的核苷酸序列SEQ ID NO:4所示,所述ZIP2的核苷酸序列SEQ ID NO:5所示。
8. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤五中,所述普通的PCR反应体系如下:
总反应体系25μL:
2*Vazyme LAMP Master Mix:12.5μL;
ZIP-F:1μL;
ZIP-R:1μL;
cDNA:1μL;
ddH2O:9.5μL;
所述普通PCR反应程序:94℃预变性4min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃补充延伸10min;PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测。
9. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤六中,所述实时荧光定量PCR检测,包括:
利用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix,即Bio-RAD试剂盒及ZIP基因检测引物、内参引物,采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测;荧光定量PCR结束后对结果进行熔解曲线分析,再次验证扩增的特异性。
10. 如权利要求4所述的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法,其特征在于,步骤六中,所述实时荧光定量PCR的过程中,扩增程序为:95℃预变性15min;95℃变性10s;60℃退火30s;共40个循环;PCR完成后按0.1℃s-1升温速率从72℃上升至95℃进行溶解曲线的分析验证;采用实时荧光定量PCR仪进行;循环结束后,采用仪器自带的分析软件,分析扩增结果;
每个qPCR反应重复三次;记录qPCR反应体系的Ct值;根据2^(-ΔΔCt)计算基因在不同处理下的相对表达量,ZIP1在叶片中和根中的表达量没有显著差异,而ZIP2在新叶中表达量急剧下降,在根中没有明显变化。