尊敬的复审委合议组:

您好!

本意见陈述书是对贵局于2021年06月11日就本申请(申请号:201810076484.6)发出的驳回决定通知书提出的复审答复。申请人在仔细阅读、认真研究审查员的驳回意见,并重新阅读本申请文件所记载的相关内容后,修改申请文件并陈述意见如下:

一、修改说明

1、将原权利要求1~3合并形成新权利要求1;

2、将原权利要求4变成新权利要求2。

以上修改没有超出原说明书和权利要求书记载范围,符合专利法第33条规定。修改后的权利要求相见权利要求书替换页。

二、修改后的权利要求1具备创造性

本申请与对比文件1相比至少具有如下区别特征:

(1)权利要求1保护的是鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的构建方法,对比文件1研究的是TREM-2在成纤维细胞样滑膜细胞中的表达;(2)具体构建方法不同。

基于上述区别特征,审查员在驳回通知中指出:在对比文件1的基础上,本领域技术人员有动机构建TREM-B2过表达稳转细胞株来研究TREX-B2对不同组织细胞的影响。对比文件2公开了鸡来源的TREM-B2的核苷酸序列,并且其编码的氨基酸序列分别与本申请SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列完全一致。在此基础上,本领域技术人员能够根据使用的载体类型和基因序列信息在基因两端添加合适的酶切位点进而得到如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。对比文件3公开了TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化,在此基础上,本领域技术人员有动机研究过表达TREN2对人肝癌细胞系的影响及过表达TREM-B2对鸡肝瘤细胞的影响。即在对比文件1的基础上,结合对比文件2和3公开的内容,本领域技术人员有动机且能够构建得到鸡肝癌细胞TREXM-B2基因过表达稳转株。因此,在对比文件1的基础上结合对比文件2-3以及本领域常规技术手段,得到权利要求1的技术方案是显而易见的,不具有突出的实质性特点和显著进步,不具备专利法第22条第3款规定的创造性。

    对此,申请人无法赞同,理由如下:

其一,从要解决的技术问题来看:本申请是要提供一种鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的构建方法。对比文件1则是要研究TREM-2在成纤维细胞样滑膜细胞中的表达。TREM-B2只在家禽中存在,而TREM-2则是在人等哺乳动物中存在,尽管两者具有较高的同源性,也仅为43.6%。而且同源性只能说明TREM-B2和TREM-2的某些基因可能具有同一“基因祖先”,不能对两者的基因过表达稳转株构建过程以及对不同组织细胞的影响乃至其他研究过程产生指导意义,毕竟物种的差距是很明显的。因此,本申请与对比文件1要解决的技术问题并不相同。

其二,从技术构思和具体的技术方案来看:本申请鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的构建思路为:(1)人工合成5’端含有酶切位点EcoRI3’端含有酶切位点BamHI并包含有TREM-B2 cDNA全序列信息的核苷酸序列;(2)将慢病毒过表达质粒pCD513B-1TREM-B2核苷酸序列进行EcoRIBamHI双酶切处理,并通过T4连接酶构建pCD513B-1-TREM-B2重组质粒,然后转化Stabl3感受态细胞,扩大培养后提取质粒得到pCD513B-1-TREM-B2重组质粒;(3)pCD513B-1-TREM-B2重组质粒与病毒包装质粒pMD2.GpsPAX2共转染至肝癌细胞中,进行病毒包装,通过荧光细胞的数量对病毒滴度进行监控;(4)病毒滴度以MOI=58感染鸡肝癌细胞时,加入终浓度为58 μg/mlpolybrene协助病毒;将感染病毒的所述鸡肝癌细胞进行正常传代后,加入嘌呤霉素进行筛选,连续培养810天,然后将细胞进行冻存处理,得到鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株。对比文件1全文阐述的是如何通过RNA干扰和基因转染研究从RA患者分离的HLSs中TREM-2的表达,以确定TREM-2在RA-FI Ss中的表达是下调还是上调。还研究了炎症因子和信号转导分子在RA-FL Ss中的表达,以阐明TREM-2在RA中的调节和机制。具体技术构思包括将从临床患者体内取出的滑膜组织进行处理后培养得到FLSs用于后续实验;接下来考察TREM-2蛋白在FLSs中的表达;然后进行瞬时siRNA转染;再采用慢病毒感染RA-FLS,然后通过RT-PCRqPCR进行检测分析以及蛋白质印迹分析。对比文件1中采用慢病毒感染RA-FLS的具体过程为:含有慢病毒的上清液添加到含有溴化六聚氰菊酯(Polybrene)的RA-FLS培养物中。用嘌呤霉素(1ug/ml)筛选过表达TREM-2的细胞,24h后用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和westernblot验证稳定的细胞系。本申请进行转染及感染的具体操作为:pCD513B-1-TREM-B2重组质粒与病毒包装质粒pMD2.GpsPAX2共转染至肝癌细胞中,进行病毒包装,通过荧光细胞的数量对病毒滴度进行监控;病毒滴度以MOI=58感染鸡肝癌细胞时,加入终浓度为58 μg/mlpolybrene协助病毒;将感染病毒的所述鸡肝癌细胞进行正常传代后,加入嘌呤霉素进行筛选。显然,本申请和对比文件1在转染及感染上的操作方式完全不相同,采用的慢病毒载体也不相同。并且从本申请和对比文件1的整体技术方案来看,是基于完全不同的技术构思,因此,对比文件1无法对本申请构成显而易见的技术启示。

进一步地,对比文件2公开的是鸡TREM-B2的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列。对比文件3公开的是TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化。首先,每种基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列通过现有的技术手段都是容易获知的,但获知了核苷酸序列及其编码的氨基酸序列并不等同于获知了核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的后续应用方法。其次,对比文件3公开的是TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化,申请人不明白的是TREM2 siRNA能够抑制人肝癌细胞系的分化构建鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株之间到底有何关联。本申请只是以鸡肝癌细胞作为宿主细胞,利用GFP荧光和嘌呤霉素共同筛选的TREM-B2重组蛋白转染鸡肝癌细胞来提高亚克隆的成功率,以解决亚克隆假阳性发生率高和重组蛋白质的下游纯化过程,并未研究TREM-B2是否抑制鸡肝癌细胞系的分化。在对比文件1与本申请基于不同技术构思的基础上,如何将对比文件1和对比文件3相结合进而评价本领域技术人员有动机构建鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株,申请人更是不解。退一步讲,即便本领域研究人员产生了构建得到鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的动机,但对比文件1~3全文都未公开本申请前述的技术构思或是给出相关教导,那么本领域技术人员又如何能知晓本申请的详细技术方案呢。至于PCD513B-1这种慢病毒载体的应用,在本领域还有很多常见的慢病毒载体,比如Gibco LV-MAX、FFluc.-GFP-T2A-Puro、EZ-editor等都属于本领域常用的慢病毒载体,为何申请人不去选择它们而偏要选择PCD513B-1。再就是转染及感染过程,针对不同的细胞载体、不同的构建目标物这些过程都需要重新设计。而现有技术并未启示或者教导在面对鸡肝脏细胞系TREM-2B基因过表达稳转株的构建问题时,如何选择慢病毒过表达质粒以及转染和感染的体系及具体操作过程,最终的技术效果更是无法预期。此外,而如果面对需要构建鸡肝癌细胞TREM-B2基因过表达稳转株的技术问题时,研究人员对包含有TREM-B2 cDNA全序列信息的核苷酸序列进行人工合成、利用慢病毒质粒对人工合成的核苷酸序列进行双酶切处理,并找寻转染、感染体系及方法,最终得出合适的构建技术(即本申请技术方案的形成过程),这个过程本身属于一种典型的创新研究行为,至于构建效果只有通过实际检测过程获知,而无法预期。

因此,在对比文件1给出了与本申请完全不同的技术构思的前提下,即便结合对比文件2和3,也不能显而易见地得出本申请的技术方案,本申请具有突出的实质性的特点。

其三,从有益效果上看:本申请的有益效果为:1)本发明宿主细胞为经过驯化的鸡肝癌细胞(LMH)系,解决了鸡原代细胞较难培养、传代后不易贴壁培养等问题。2)本发明利用GFP荧光和嘌呤霉素共同筛选的TREM-B2重组蛋白转染鸡肝癌细胞后提高了亚克隆的成功率,此方法解决了亚克隆假阳性发生率高和重组蛋白质的下游纯化过程。3)本发明TREM-B2过表达的鸡肝癌细胞(LMH)系较未转染鸡肝癌细胞TREM-B2表达量显著提高,此方法解决了一般肝脏细胞TREM-B2表达量低的问题,为TREM-B2的功能研究提高了技术支持平台。此外,在本申请具体实施例中还验证了“鸡肝癌细胞(LMHTREM-B2过表达稳转株中TREM-B2 mRNA的表达丰度比原鸡肝癌细胞(LMH)高78”。而对比文件1的技术效果为成功探究了TREM-2在成纤维细胞样滑膜细胞中的表达及其通过抑制p38通路激活对TNF-o诱导炎症的抑制作用。对比文件3则公开了TREM2 siRNA 能够抑制人肝癌细胞系的分化结果。显然,三者的侧重点均不相同,换个角度说,对比文件1获得了对比文件1-3不能获得的有益效果。因此,本申请较比现有技术具有显著进步性。

综上,修改后的权利要求1既具有突出的实质性的特点,也具有显著的进步。权利要求1具有创造性。符合专利法第22条第3款的规定。

三、权利要求2具有创造性

权利要求2是独立权利要求1的直接从属权利要求,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求2也具备创造性。符合专利法第22条第3款的规定。

综上所述,本申请的权利要求1~2与对比文件1~3结合公知常识相比,是基于不同的技术问题,采用不同的技术构思和技术方案进行的发明,且技术效果也更为显著。对比文件1~3 的综合方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~2的技术方案相较与对比文件1~3具有突出的实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定的创造性。

申请人认为,通过上述陈述,已克服通知书中所指的缺陷,使本申请符合专利法第22条第3款的规定。希望审查员在此基础上重新审查并撤销驳回决定。如果审查员认为申请文件中仍有不符合专利法规定之处,恳请能够再给予一次修改/陈述意见的机会,申请人愿意积极配合审查员的审查工作。