尊敬的审查员：

本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年07月19日发出的关于《一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用》的第二次审查意见通知书，对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述，申请人进行了认真的研读，并作出以下意见陈述。

意见陈述

1）权利要求1具有创造性

本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征：权利要求1限定了用于扩增公牛ZNF280AY基因的引物对P1的核苷酸序列和用于扩增参考基因SRY的引物对P2的核苷酸序列。

针对上述区别技术特征，审查员在二审意见通知中进一步结合对比文件1-3驳斥了本申请的创造性。对此，申请人有不同看法，理由如下：

首先，权利要求1的PCR扩增引物对具体包括引物对P1和引物对P2，引物对P1由上游引物F1和下游引物R1组成，引物对P2由上游引物F2和下游引物R2组成，并且上游引物F1、下游引物R1、上游引物F2和下游引物R2分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。对比文件1的目的是要进行3方面的研究：（1）北美荷斯坦牛的父系系谱；（2）利用qPCR方法检测15个家牛品种Y染色体PRAMEY基因、HSFY基因、ZNF280BY基因的拷贝数变异；（3）利用VeraCode 384 OPA基因芯片技术研究公牛Y染色体单拷贝基因的SNPs和多拷贝基因的遗传变异。其公开的是利用qPCR方法检测15个家牛品种Y染色体PRAMEY基因、HSFY基因、ZNF280BY基因的拷贝数变异，在对比文件1 P16-17页、3.2小节、4.2小节对前述3种基因拷贝数变异的研究目的和研究内容进行了详细描述。根据对比文件1公开的内容可知，尽管已知牛Y染色体的扩增区含有四个大量扩增的多拷贝基因家族包含HSFY、TSPY、ZNF280BY、ZNF280AY，但包括对比文件1作者在内的本领域技术人员也不能确定这4种基因是否存在拷贝数变异，且这种变异是否与公牛的繁殖性状相关，那么根据对比文件1公开的研究内容，目前只能获知PRAMEY基因、HSFY基因、ZNF280BY基因拷贝数变异的相关内容。退一步而言，即便对比文件1披露了同源基因ZNF280AY和ANF280BY具有较多的共同特征，但并未具体教导如何根据这些特征进行检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的PCR扩增引物对的具体设计。即便结合对比文件2公开的牛ZNF280AY基因的mRNA序列，本领域技术人员最多可以得到进一步对牛ZNF280AY基因进行拷贝数变异的研究方向的技术启示，而非具体的技术内容。这一点在对比文件1的6.2小节也有体现：“（1）进一步对其他牛Y染色体多拷贝基因，如TSPY、ZNF280AY和EGLY等进行拷贝数变异研究……”。此外，针对引物的具体设计过程，Primer Premier5．0确实为现有的软件，但这并不意味着引物的设计过程就不具有创造性，其中会有诸多影响PCR成功与否的因素，比如：引物的长度、引物序列的相似性、末位碱基的选择、引物序列的GC含量、引物的修饰位点等等。而这些都是靠研究者来摸索，现有技术并没有具体的教导。至于审查意见中提出的对比文件3中公开了SRY引物序列，本申请说明书P11段已经阐明“参照基因SRY为已知的牛Y染色体单拷贝基因……”。本申请的创新点在于ZNF280AY基因扩增的引物对设计以及利用SRY基因作为参照基因，将两者进行有机结合。因此，申请人还是认为，即便结合对比文件1-3和本领域的常规技术手段也不能显而易见地得出权利要求1要求保护的技术方案。

在者，本申请获得了显著进步，技术效果总结如下：本发明与多重连接探针扩增、AccuCopy多重CNV检测、荧光原位杂交技术相比具有灵敏度高，成本低，操作简单快捷，便于实验室常规操作的优点；还可实现大样本检测，克服了测序法成本高和探针杂交法信噪比高的缺点。此外，本发明将拷贝数变异与繁殖性状作关联性分析，以期将ZNF280AY基因作为公牛繁殖性状选择的有效分子标记，从而加速公牛繁殖力的选育效果（在本申请的具体实施例中进行了不同牛种ZNF280AY基因拷贝数的鉴定、ZNF280AY基因拷贝数变异与繁殖性状的关联分析，详见表7-10）。相比之下，对比文件1获得的是PRAMEY基因、HSFY基因、ZNF280BY基因的拷贝数变异结果。对比文件2-3的结果则与本申请毫不相关。显然，本申请具有显著的技术进步。

因此，权利要求1较比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第二十二条第三款规定的创造性。

2）权利要求2-4具有创造性

权利要求2保护的是一种用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的试剂盒，包括权利要求1所述的PCR扩增引物对，在权利要求1具备创造性的前提下，权利要求2也具备创造性。

权利要求3保护的是一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法，利用的是权利要求1所述的PCR扩增引物对，在权利要求1具备创造性的前提下，权利要求2也具备创造性。此外，本申请具体反应过程的条件与对比文件1公开的反应条件也不相同，针对不同基因的PCR扩增需要找寻适应的反应条件才能获得好的结果。基于对比文件1要研究的基因与本申请要研究的基因存在较大区别，对比文件1的PCR扩增条件并不能给本申请带来显而易见的技术启示。

权利要求4保护的是权利要求1所述的用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的PCR扩增引物对或者权利要求2所述的用于检测公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的试剂盒或者权利要求3所述的检测方法在公牛辅助选择和分子育种中的应用。在前述权利要求具备创造性的前提下，权利要求4也具备创造性。

综上所述，本申请的权利要求1~4与对比文件1-3结合公知常识相比，是基于不同的技术问题、采用不同的方案进行的发明，且技术效果也有本质不同。对比文件1-3的技术方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示，也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~4的技术方案相较与对比文件1-3具有实质性特征和显著性进步，具备专利法22条3款所规定的创造性。

如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷，请给申请人提供修改和陈述意见的机会，申请人将尽力配合审查员的工作，谢谢审查员。