尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年05月06日发出的关于《一种金龙胆草离体细胞的培养方法》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求1和3合并成新权利要求1;
将原权利要求4~6依次变成新权利要求3~5,并更改相应的引用关系。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
修改后的权利要求详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)修改后的权利要求1具有创造性
本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:1)本申请针对的是金龙胆草离体细胞的培养,对比文件1针对的是金龙胆草组织培养并炼苗栽培;2)具体的培养过程及结果不同。
审查员在一审通知书中结合对比文件1-2反驳了本案的创造性,申请人拟从以下3个方面阐述意见:
其一,从实际要解决的技术问题来看:本申请针对现有繁殖金龙胆草技术存在的时间周期长、需要栽培来获得药效成分、受地理因素限制等问题,提供一种金龙胆草离体细胞的培养方法。而对比文件1则是为了解决现有栽培技术存在的污染率高、死亡率高、褐化率高、出根率低以及移栽存活率低的问题,提供一种金龙胆草组织培养方法。显然,一方面本申请针对的是一种细胞培养技术,而对比文件1针对的是一种组织栽培技术,两者的技术目的存在较大区别。另一方面本申请能够解决“通过金龙胆草栽培来获得有效成分、时间周期长”的技术问题,而对比文件1采用的就是栽培前期的组织培养技术,因此,本申请解决了对比文件1不能解决的技术问题。
其二,从技术构思和具体的技术内容来看:本申请培养金龙胆草离体细胞的技术构思为:将金龙胆草幼嫩且叶表面积相对较大的新叶中的单细胞分离出来建立悬浮细胞系,然后稳定继代培养。具体的培养方法包括以下步骤:
步骤1、外植体的选择与灭菌:采集幼嫩且叶表面积相对较大的新叶作为备用外植体;在超净工作台中,将外植体于无菌水下冲洗,用无菌滤纸吸干残留水份;将处理后的叶片转入70%酒精浸泡10s-30s,取出后立即用大量无菌水冲洗3-5遍,然后放入0.1%HgCl2浸泡6-10min,结束后立即用大量无菌水冲洗3-5遍,之后将外植体放在无菌滤纸上吸干水份,并用无菌手术刀将叶脉切掉;
步骤2、金龙胆草叶片单细胞分离:用70%酒精喷施牛肚匀浆器灭菌,带酒精挥发干后,备用;采用机械法分离单细胞,将处理好的叶片转入含有STN缓冲液的无菌牛肚匀浆器中,快速研磨匀浆;过无菌细胞筛,收集金龙胆草离体单细胞;
步骤3、建立金龙胆草悬浮细胞系:吸取机械分离得到的细胞液,接种于悬浮细胞培养液中,接种后的培养液置于摇床中培养,采用SCAR鉴定该悬浮细胞是否为金龙胆草悬浮细胞;
步骤4、稳定继代培养:吸取鉴定为金龙胆草亲代悬浮细胞系,转入新的悬浮培养液中培养3天;所述悬浮细胞培养液为MS+蔗糖30mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1+6-BA 0.1mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+甘露醇0.3M,pH值为5.5。本申请最终获得还是细胞。
而对比文件1的技术构思为:将生长健壮且无病虫害的新叶处理成片段后进行接种与培养,然后愈伤组织诱导出芽,再将长出新芽的愈伤组织进行增殖分化培养和根的诱导,出根后炼苗与移栽。具体的培养方法包括以下步骤:
1)外植体的选择与灭菌:采集生长健壮且无病虫害的新叶作为外植体;将外植体于流 水下冲洗30min,沥干残留水份,置于冰上放置1h;冰浴结束后放入干净的大培养皿带进超 净工作台用70%酒精浸泡10s,取出后立即用无菌水冲洗3-5遍,然后放入0.1%HgCl 2浸泡 8min,结束后立即用无菌水冲洗3-5遍,之后将外植体放在无菌滤纸上吸干水份,备用;
2)外植体的接种与培养:将处理好的外植体用无菌手术刀均匀切割成1cm 2以上的片段; 切割完全后,按每个培养皿3个外植体将其均匀接种在预先准备好的愈伤组织诱导培养基上,在20℃的条件下,用封口膜将培养皿封好放入无光照的培养箱进行黑暗培养,黑暗培养 3d,之后转入光照培养箱光照培养,光照培养3周;在配置愈伤组织诱导培养基时向愈伤组 织诱导培养基中加入1-5mg·L -1的抗坏血酸;
3)愈伤组织诱导出芽:将长势良好的愈伤组织分割成米粒大小,按每个培养皿5个均匀 接种在含有不同激素及配比的芽诱导培养基上,用封口膜将培养皿封好放入光照培养箱光 照培养,培养条件与步骤2)中的光照培养条件相同,培养2周;
4)增殖分化培养:当愈伤组织长出不定芽后,将分化较好的愈伤组织转接入含有不同激素及配比的增殖分化培养基中,按照步骤2)中所述的光照培养条件进行培养;经过几轮 继代培养后,得到分化苗;
5)根的诱导:将长势良好且苗高在2cm的分化苗用无菌手术剪剪下,一苗一株,避开侧芽,将其接种到含有不同激素及配比的生根诱导培养基上进行生根诱导培养;培养条件与 步骤2)中的所述培养条件所述相同;7d-10d开始出根;
6)炼苗与移栽:在分化苗分化出根后,再培养3周时间,待无菌苗各部位组织器官分化 完全且长势健壮后,将培养瓶放入炼苗室,打开瓶盖炼苗3d;然后,小心取出组培苗,用自来 水洗去根部残留的培养基,注意不要损伤植株,移栽到组培苗专用营养土中,进行正常化管理,移栽成活率在90%以上;步骤2)中的愈伤组织诱导培养基具体是:MS+2,4-D 1.0mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1+ Vc 5.0mg·L-1;步骤3)中的芽诱导培养基为:MS+NAA 0.1mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1;步骤4)中的增殖分化培养基为:MS+GA3 1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1;步骤5)中的生根诱导培养基为:1/2MS+GA3 0.1mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1。对比文件1最终获得的是栽培苗。显然,本申请与对比文件1是基于完全不同的技术构思,所采用的具体培养方法也有显著区别,最终获得的培养结果更是不同。对比文件1的技术方案无法对本申请构成显而易见的技术启示。
进一步地,审查员提出的公知常识性证据“《植物细胞组织培养技术》和《光合作用效率》”,只是分别给出了植物细胞悬浮培养的一般程序,而且在进行单细胞分离时不可避免是要使用植物根茎叶中的一种,这是所有细胞培养必经步骤,但两篇公知常识性证据均未具体教导在面对金龙胆草离体细胞的培养问题时如何进行外植体的选择与灭菌、单细胞分离、建立悬浮细胞系和稳定继代培养,从而建立适宜金龙胆草单细胞培养的整体适宜方法。所有创新技术的产生都离不开现有技术的应用,一个整体而完备的技术方案中不可能所有步骤、过程都是新东西新内容,必然需要将现有的一些手段、内容相结合从而构成一套整体技术方案,彼此相辅相成缺一不可。
再进一步地,对比文件2公开的是一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法,其采用SCAR技术的目的是为了区分金龙胆草及与金龙胆草非常接近的植物。本申请确实参考了申请人的在先专利,采用SCAR来鉴别金龙胆草悬浮细胞,但SCAR技术在两篇专利中应用的作用还是有区别的,由于本案并不存在与金龙胆草相似的混淆品,只是需要区分哪些属于悬浮细胞哪些不是而已。而在对比文件2中则是为了区分金龙胆草与其混淆品。此外,尽管公知常识性证据《植物细胞组织培养技术》中公开了“为了使分批培养的细胞能不断增殖,必须进行继代”,但同样在面对金龙胆草离体细胞的技术问题时,其并未教导如何进行外植体的选择与灭菌、单细胞分离、建立悬浮细胞系和稳定继代培养,从而建立适宜金龙胆草单细胞培养的整体适宜方法。
再者,本申请采用的悬浮细胞培养液为MS+蔗糖30mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1+6-BA 0.1mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+甘露醇0.3M,pH值为5.5。本领域公知,培养基对于细胞、组织的培养至关重要,其中的成分需要协同起作用,并非某一种两种成分能够决定整个功效。对比文件1公开的培养基为:MS+2,4-D1.0mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+ Vc5.0mg·L-1,一方面,对比文件1与本申请的培养对象存在较大差别,而且也并未教导如何在删除Vc的基础上加入KT和甘露醇从而可以获得适合单细胞培养的培养基组成。至于公知常识性证据《植物细胞组织培养技术》和《中药生物技术》只是对蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨糖醇等糖类的作用进行了论述,并未教导要在悬浮细胞培养液中加入KT和甘露醇以及如何形成适合金龙胆草单细胞的悬浮培养基的整体复配方式。
此外,《审查指南》第二部分第四章第3.2.1小结规定:
“判断过程中,要确定的是现有技术整体上是否存在某种技术启示,即现有技术中是否给出将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题(即发明实际解决的技术问题) 的启示,这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时,有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明。”审查意见中只是将本申请权利要求1中区别于对比文件1的内容完全与本申请整个技术方案隔离开,单独孤立地评述这几种组分,不符合创造性判定原则。也可以合理的认为:审查意见的观点是在基于知晓本申请的发明目的、技术方案和效果之后,受本申请整体发明构思的启示而倒推得到,这不符合上述审查指南内容的精神。
因此,综上所述,即便本领域技术人员结合对比文件1、2和本领域常规技术手段,也无法得到本申请的技术方案,本申请较比对比文件1-2具有突出的实质性特点。
其三,本申请较比2篇对比文件的技术效果显著。
本申请的技术效果为:1)本发明通过细胞工程技术,培育金龙胆草离体细胞,在短时间内快速增殖,并从金龙胆草悬浮细胞系中获得药效成分。2)本发明周期较组织培养更短,同时不需要栽培金龙胆草,不受地理因素限制。显然,本申请解决了对比文件1需要栽培金龙胆草的技术问题,获得了对比文件1无法获得的技术效果。对比文件2则是可以通过SCAR标记的方法对金龙胆草及其混淆品进行区分,和本申请无法进行技术效果的比较。因此,本申请较比对比文件1-2具有显著进步。
2)修改后的权利要求2-5具有创造性
权利要求2-5为权利要求1的从属权利要求,在权利要求1具备创造性的前提下,其从属权利要求也具备创造性,权利要求1的创造性如前所述。
综上所述,本申请的权利要求1-5与对比文件1-2结合公知常识相比,是基于不同的技术问题、采用不同的构思和技术方案进行的发明,且技术效果也有本质不同。对比文件1-2的技术方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1-5的技术方案相较与对比文件1-2具有突出的实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定的创造性。
如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷,请给申请人提供修改和陈述意见的机会,申请人将尽力配合审查员的工作,谢谢审查员。