1. 一种金龙胆草离体细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、外植体的选择与灭菌:采集幼嫩且叶表面积相对较大的新叶作为备用外植体;在超净工作台中,将外植体于无菌水下冲洗,用无菌滤纸吸干残留水份;将处理后的叶片转入70%酒精浸泡10s-30s,取出后立即用大量无菌水冲洗3-5遍,然后放入0.1%HgCl2浸泡6-10min,结束后立即用大量无菌水冲洗3-5遍,之后将外植体放在无菌滤纸上吸干水份,并用无菌手术刀将叶脉切掉;
步骤2、金龙胆草叶片单细胞分离:用70%酒精喷施牛肚匀浆器灭菌,带酒精挥发干后,备用;采用机械法分离单细胞,将处理好的叶片转入含有STN缓冲液的无菌牛肚匀浆器中,快速研磨匀浆;过无菌细胞筛,收集金龙胆草离体单细胞;
步骤3、建立金龙胆草悬浮细胞系:吸取机械分离得到的细胞液,接种于悬浮细胞培养液中,接种后的培养液置于摇床中培养,采用SCAR鉴定该悬浮细胞是否为金龙胆草悬浮细胞;
步骤4、稳定继代培养:吸取鉴定为金龙胆草亲代悬浮细胞系,转入新的悬浮培养液中培养3天;
所述悬浮细胞培养液为MS+蔗糖30mg·L-1+2,4-D 1.0mg·L-1+6-BA 0.1mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+甘露醇0.3M,pH值为5.5。
2.根据权利要求1所述的金龙胆草离体细胞的培养方法,其特征在于,所述步骤1中的外植体的灭菌条件为:先用70%酒精浸泡10s,然后再用0.1%HgCl2浸泡8min。
3.根据权利要求1所述的金龙胆草离体细胞的培养方法,其特征在于,所述步骤2中的STN缓冲液的pH为7.5。
4.根据权利要求1所述的金龙胆草离体细胞的培养方法,其特征在于,所述步骤3中的匀浆时间为0.5-1.5min,无菌细胞筛的筛目数为180-220目。
5.根据权利要求1所述的金龙胆草离体细胞的培养方法,其特征在于,所述步骤3中的培养温度为25℃,转速为100-120rpm。