尊敬的国家知识产权局:
申请人收到了国家知识产权局对申请号为201810388088.7发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动,申请人仔细阅读了审查意见通知书正文,按通知书的要求进行了修改,申请人提出以下意见,希望和审查员商榷:
一、修改说明:
1、将权利要求2和3中的附加技术特征加入到权利要求1中,形成新的权利要求1。
2、删除权利要求2和3,并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系。
以上修改没有超出原权利要求书和说明书的范围。详见修改后的权利要求书。
二、关于事实认定部分
(1)审查意见认为:SEQ
ID NO. 1 -2 所示引物不能扩增得到SEQ ID NO. 3所示的440bp的PCR产物。并且,由于正向引物与SEQ ID NO. 3所示的目标区域仅存在7bp的匹配碱基,下游引物也存在错配碱基,因而本领域技术人员不能合理预期所述引物扩增SRY基因的特异性、灵敏度、准确性等技术效果。退一步讲,即便该引物可以扩增得到包含该SNP位点的片段,所得PCR产物序列也不是SEQ ID NO. 3所示的440bp核苷酸序列,其仅能得到SEQ ID NO. 3所示第 111-438bp的部分片段,则本申请所述的SNP在第lll-438bp部分片段中的实际位置并不是第215bp位。
(2)根据说明书记载的酶切位点(如上述SEQ ID NO. 3中的箭头“丨”所示)和突变基因型的酶切片段的数量及长度可知,第一个酶切识别位点位于SEQ ID NO. 3所示序列的第63bp位碱基处(产生63bp酶切产物片段,即第l-63bp核苷酸),第二个酶切识别位点位于SEQ ID NO. 3所示序列的第214bp位碱基处(产生151bp 和54bp酶切产物片段,即第64-214bp核苷酸和第215-268bp核苷酸),第三个酶切识别位点位于SEQ ID NO. 3 所示序列的第268bp位碱基处(产生172bp酶切产物片段,即第269-440bp核苷酸)。
然而,由于所述引物仅能扩增第lll-438bp的部分片段,因而实际扩增产物不包含所述位于第63bp的 第一个酶切识别位点。并且,包含所述SNP位点的核苷酸序列片段为ctctg/agtaag,其并不存在Hpyl88I的识别位点TCAGA/TCTGA,因而无论该SNP位点具体是何种基因型,其均不能被Hpyl88I酶切。因此,利用所 述引物对和限制性内切酶Hpy 1881不能产生3或4条酶切产物片段,也不能根据所述PCR-RFLP产物的电泳条带的数量和大小区分SNP基因型。
(3)说明书实施例3记载了利用上述SNP多态性检测方法对绵羊DNA样品进行SNP多态性的鉴定,统计各
品种的基因频率以及该SNP与白萨福克羊睾丸大小之间的关联分析。然而,参见前述审查意见,由于所述SNP 检测方法的技术方案不合理,因而实施例中利用该方法检测得到的SNP标记信息、检测该SNP的引物和方法 及其应用的技术效果均不具备证明力。因此,本领域技术人员有理由怀疑采用该方法检测SNP标记基因型并进行性状关联性分析的准确性。
三、关于修改后的权利要求1的创造性
修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于:正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;PCR反应体系为:2×EasyTaqSuperMix 12.50 µL,正向引物0.4 µL,反向引物
0.4 µL,双蒸水10.7 µL,DNA模板 1µL,以上体积总量为25µL;PCR扩增反应程序为: 94℃预变性5 min;94℃变性30 s,62.6℃退火30 s,72℃延伸30 s,34个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。
所述的单核苷酸多态性位点表现为第215 bp位G或A的单核苷酸多态性,具有AA和GG两种基因型,电泳结果分别为:AA型表现为54 bp、63 bp、151 bp和172 bp四个条带;GG型表现为63
bp、172 bp和205 bp三个条带。
基于上述区别技术特征,本发明利用RFLP-PCR方法对绵羊SRY基因片段的第215 bp位上的突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测,当位点由G突变为A时,为G>A的突变,该突变未引起氨基酸的改变,属于同义突变,使具有重要生理功能的SRY基因所编码蛋白的空间二、三级构型未发生变化。针对上述SRY基因的SNP多态性,本发明还公开了其检测方法,通过设计特定的PCR引物扩增片段,能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。由表4和表5可知,对于Hpy188I可识别的第215位的SNP位点只在萨福克羊和白萨福克羊两个品种中表现出多态性,而在特克塞尔羊、杜泊羊、东弗里升羊、南非肉用美利奴羊、湖羊、藏羊和滩羊中则没有表现出多态性。在萨福克羊和白萨福克羊群体中GG基因型为优势基因型;性状关联分析表明,在白萨福克羊群体中,GG基因型个体的睾丸大小显著的高于AA基因型。结果说明SRY基因215
bp的SNP位点可作为鉴别萨福克和白萨福克羊的父系分子遗传标记,GG基因型可以成为一个提高白萨福克羊睾丸大小的分子遗传标记。根据这个研究结果,绵羊育种工作者可以通过本发明进行胚胎性别鉴定、绵羊父系单倍型鉴定和提高公羊繁殖力。
对比文件2 (CN106755371A, 公开日为20170531)是最接近的现有技术,其公开了利用PCR-RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法;使具有重要生理功能的PCNP基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化;也不可以通过本发明进行胚胎性别鉴定、绵羊父系单倍型鉴定和提高公羊繁殖力,两者技术效果不同;因此,本申请相对于对比文件2具有预料不到的技术效果。
对比文件1没有公开“使具有重要生理功能的SRY基因所编码蛋白的空间二、三级构型未发生变化”技术效果,也不可以通过本发明进行胚胎性别鉴定、绵羊父系单倍型鉴定和提高公羊繁殖力,对比文件3没有公开上述区别技术特征和技术效果,因此,对比文件1-3相结合对修改后的权利要求1不构成技术启示;且上述区别技术特征也不是本领域的公知常识,修改后的权利要求1相对于对比文件1-3和公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。
三、关于修改后权利要求2的创造性
在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,其从属权利要求2也必然具有创造性。
四、关于修改后权利要求3和4的创造性
修改后权利要求3和4与修改后的权利要求1具有单一性,在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,修改后权利要求5和6也必然具有创造性。
综上所述,本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。如有问题,望及时联系申请人或代理人,给予再次答复的机会,
联系电话:13551134124。
请审查员继续审查。
致礼
申请人:兰州大学
2021年09月29日