1. 一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,该方法通过(AGGGTTT) 3寡序列探针及包含该探针的试剂盒实现,所述(AGGGTTT) 3寡序列探针的碱基序列为:5′- AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTT-3′,用于识别并标记林木染色体端部;所述试剂盒包括:(1)所述探针;(2)酶解液;(3)20×SSC缓冲液;(4)2×SSC缓冲液;(5)70%FA液;(6)50%DS液;(7)鲑鱼精DNA;所述林木为Croton tiglium、Erythrina crista-galli、Litseabaviensis、Litsea elongata、Podocarpusmacrophyllus、Quercusaquifolioides、Robiniapseudoacacia中的一种;所述方法包括以下步骤:
1)获取林木染色体载玻片标本:剪取林木种子新生1.0~1.5cm根尖组织,依次用冰水混合物处理18~24h、冰醋酸处理5min,用双蒸水清洗后,切取根尖分生组织1~2mm,置于酶解液中于37℃酶解45~60min;
去除酶解液,依次用双蒸水、70%、90%、100%酒精依次清洗根尖分生组织,再加入冰醋酸制成根尖组织悬浮液,滴于载玻片上,晾干,镜检,将能清晰观察到染色体的载玻片进行标记,并置于-20℃保存箱中保存;
2)变性:准备好灭菌的1.5mL离心管,每管加入2μL鲑鱼精DNA,0.5μL探针,然后加入10μ L100%FA、2μL 20×SSC和4μL50%DS,混匀后瞬时离心,于沸水浴中变性10min,立即置于冰上放置20min,防止其复性;
3)荧光原位杂交:将步骤1)中的载玻片用2×SSC缓冲液处理两次,每次5min,再依次用70%酒精、90%酒精、100%酒精梯度处理,每次5min,室温晾干后滴加70%FA液,盖上盖玻片,于80℃处理2min;
之后依次用70%酒精、90%酒精、100%酒精梯度处理,每次5min,晾干后滴加10μL步骤2)的变性混合液,遮光下将载玻片于37℃恒温箱中放置1.5~2h,依次用2×SSC缓冲液清洗 3min、双蒸水清洗3min,最后在常温下晾干;
4)信号检测:晾干后的载玻片上加入DAPI,用荧光显微镜进行检测,并采集检测图像;
5)回收载玻片:将载玻片置于2×SSC缓冲液中,60℃水浴10min,用70%、90%、100%酒精分别处理10min,之后于日光灯下放置24h,集中收集并置于-20℃保存箱中,以备下次使用。
2.根据权利要求1所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述探针采用FAM标记其序列的5′端。
3.根据权利要求1所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述酶解液的配制方法为:每10mLddH2O中加入2g纤维素酶和1g果胶酶。
4.根据权利要求1所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述20×SSC缓冲液的配制方法为:每1000mL的ddH2O加入88.23g柠檬酸钠和175.32g氯化钠。
5.根据权利要求4所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述2×SSC缓冲液的配制方法为:将20×SSC缓冲液稀释10倍。
6.根据权利要求1或者4所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述70%FA液由去离子甲酰胺和2×SSC缓冲液按照体积比7:3组成。
7.根据权利要求1所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述50%DS液的配制方法为:每500μL ddH2O中加入0.5g硫酸葡聚糖,于37℃震荡过夜,待完全融化后瞬时离心混匀。
8.根据权利要求1所述的一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法,其特征在于,所述鲑鱼精DNA的处理方法为:将室温下溶解的10mg/mL鲑鱼精DNA高压灭菌处理10min,沸水煮沸使其DNA变性10min,-20℃保存。