一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及凝胶制剂,特别是涉及一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,还涉及所述凝胶制剂的应用。
背景技术
[0002] 勃起功能障碍(ED)指无法达到和维持勃起以达到令人满意的性交为主要表现的疾病,是最常见的一种男性功能障碍疾病,该疾病的病程持续3个月以上,其诱发因素分为器质性、手术性、外伤性、精神性和阴茎自身病变等,常规的治疗方法为口服药物治疗,但该治疗方法对药物的依赖性强,不能达到根治的目的。
[0003] 此外,研究发现脐带间充质干细胞具有多向分化、组织修复、免疫调节等多种功能,因其免疫原性极低,异体使用不会引起免疫排斥,故在临床应用中具有极大的优势。虽然脐带间充质干细胞能够一定程度上治疗和缓解ED症状,但是,直接静脉回输脐带间充质干细胞由于细胞到达阴茎部位量少,所以治疗效果有限,而将脐带间充质干细胞直接注射于阴茎中的方法相对复杂,治疗风险高。
发明内容
[0004] 基于此,有必要针对当下勃起功能障碍以静脉注射治疗为主,治疗效果有限且直接注射于阴茎中的方法相对复杂,治疗风险高的问题,提供一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法及其应用。
[0005] 一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1选取人脐带间充质干细胞,提供药用高分子稳定剂、保湿剂、透皮吸收促进剂、复方电解质注射液;
S2对所述人脐带间充质干细胞进行饥饿培养-富集浓缩,得到脐带间充质干细胞外泌体浓缩液;
S3于所述脐带间充质干细胞外泌体浓缩液中依次加入高分子稳定剂、保湿剂、透皮吸收促进剂、复方电解质注射液,混合得到干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂;
每100ml所述干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的组分如下:脐带间充质干细胞外泌体浓缩液50ml、保湿剂8ml、透皮吸收促进剂8ml、药用高分子稳定剂10g、余量为复方电解质注射液。
[0006] 上述制备方法,采用饥饿人脐带间充质干细胞进行培养的模式,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物,并基于超速离心来进行富集浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体,此外,在人间充质干细胞外泌体中加入药用高分子稳定剂、保湿剂和透皮吸收促进剂,最大限度增加外泌体的稳定性和活性,并提高其透皮吸收能力,使得治疗效果大大提高的同时,使外泌体形成稳定均一,利于吸收的凝胶状物质,为男性勃起功能障碍的治疗使用提供便利。
[0007] 在其中一个实施例中,所述人脐带间充质干细胞的选取标准为:从P2~P8代的人源脐带间充质干细胞中,选取生长状态良好和微生物检测为阴性的干细胞。
[0008] 在其中一个实施例中,所述药用高分子稳定剂为海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖和羟乙基淀粉中的任意一种;所述保湿剂为丙二醇和甘油;所述透皮吸收促进剂为二甲基亚砜。
[0009] 在其中一个实施例中,所述复方电解质注射液中,每1000ml包含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。
[0010] 在其中一个实施例中,所述饥饿培养的方法,其具体操作如下:
S21将所述人脐带间充质干细胞接种于培养基中;
S22接种培养2~4d后,吸弃全部培养上清液,并用医用复方电解质注射液清洗2~4次,后加入复方电解质注射液,置于二氧化碳培养箱中进行饥饿培养;
S23饥饿培养18~30h后,回收全部培养上清液并用滤膜过滤,经离心后回收离心上清液;
S24继续对所述离心上清液进行离心处理,后吸弃上清液中70%~80%体积的液体,沉淀物和剩余上清液混合,得到脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。
[0011] 进一步地,所述接种密度为3~5*104/cm2;所述培养基中包含体积比浓度为5%~15%的胎牛血清。
[0012] 进一步地,所述滤膜的孔径为0.22um;经所述滤膜过滤的上清液在3000~5000g的离心力条件下离心10~20min。
[0013] 在其中一个实施例中,所述脐带间充质干细胞外泌体浓缩液具有生物活性。
[0014] 一种凝胶制剂的给药方式,所述给药方式的具体操作如下:直接将干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹于阴茎皮肤及龟头处,经皮肤直接吸收进行给药;其中,所述干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂采用所述的一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法制备得到。
[0015] 一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂在男性勃起功能障碍治疗中的应用。
[0016] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的制备方法,采用饥饿人脐带间充质干细胞进行培养的模式,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物,并基于超速离心来进行富集浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体,此外,在人间充质干细胞外泌体中加入药用高分子稳定剂、保湿剂和透皮吸收促进剂,最大限度增加外泌体的稳定性和活性,并提高其透皮吸收能力,使得治疗效果大大提高的同时,使外泌体形成稳定均一,利于吸收的凝胶状物质,为男性勃起功能障碍的治疗使用提供便利。
[0017] 本发明的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,其含有浓缩3.5~9倍的脐带间充质干细胞经饥饿培养获得的脐带间充质干细胞外泌体浓缩液,脐带间充质干细胞外泌体浓缩液中的外泌体成分能调节局部组织微环境,促进血管生成,改善局部供血,从而达到改善阴茎供血、治疗勃起功能障碍的疗效。
附图说明
[0018] 图1所示为本发明实验例1治疗前后的性生活时间对比图。
[0019] 图2所示为本发明实验例2治疗前后的性生活时间对比图。
[0020] 图3所示为本发明实验例3治疗前后的性生活时间对比图。
[0021] 图4所示为本发明实验例4治疗前后的性生活时间对比图。
具体实施方式
[0022] 下面结合附图对本发明进行详细的描述。
[0023] 实施例1
本实施例提供了一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1选取人脐带间充质干细胞,提供药用高分子稳定剂(透明质酸钠)、保湿剂(丙二醇和甘油)、透皮吸收促进剂(二甲基亚砜)、复方电解质注射液。
[0024] 所述人脐带间充质干细胞的选取标准为:从P2~P8代的人源脐带间充质干细胞中,选取生长状态良好和微生物检测为阴性的干细胞。复方电解质溶液为四川科伦药业股份有限公司生产,所述复方电解质溶液中,每1000ml包含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。
[0025] S2对所述人脐带间充质干细胞进行饥饿培养-富集浓缩,得到脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。
[0026] 所述脐带间充质干细胞外泌体浓缩液具有生物活性。本实施例中,采用饥饿人脐带间充质干细胞进行培养的模式,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物,并基于超速离心来进行富集浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体。
[0027] 所述饥饿培养的方法,其具体操作如下:
S21将所述人脐带间充质干细胞接种于培养基中。
[0028] 所述接种密度为3~5*104/cm2。培养基可置于细胞培养瓶或细胞培养皿中,所述培养基中包含体积比浓度为5%~15%的胎牛血清。
[0029] S22接种培养2~4d后,吸弃全部培养上清液,并用医用复方电解质注射液清洗2~4次,后加入复方电解质注射液,置于二氧化碳培养箱中进行饥饿培养。
[0030] 接种培养2~4d后,细胞融合率达到80%~95%,细胞生长状态良好,吸弃全部培养上清液,用复方电解质注射液清洗细胞2~4次,然后加入复方电解质注射液,使溶液高度达到2~3mm,放入二氧化碳培养箱中进行饥饿培养。
[0031] S23饥饿培养18~30h后,回收全部培养上清液并用滤膜过滤,经离心后回收离心上清液。
[0032] 所述滤膜的孔径为0.22um,经滤膜过滤的上清液在3000~5000g的离心力条件下离心10~20min。
[0033] S24继续对所述离心上清液进行离心处理,后吸弃上清液中70%~80%体积的液体,沉淀物和剩余上清液混合,得到脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。
[0034] 回收的离心上清液装入离心管中,在200000~500000g的离心力条件下离心30~60min,离心结束后轻轻取出离心管,使用移液管吸弃上清液中70%~80%体积的液体,将剩余20%~30%体积的液体和离心管底部的沉淀物均匀混合,作为制备勃起功能障碍治疗制剂的原料,即脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。
[0035] S3于所述脐带间充质干细胞外泌体浓缩液中依次加入高分子稳定剂(透明质酸钠)、保湿剂(丙二醇和甘油)、透皮吸收促进剂(二甲基亚砜)、复方电解质注射液,混合得到干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂。
[0036] 本实施例中,通过在人间充质干细胞外泌体中加入药用高分子稳定剂、保湿剂和透皮吸收促进剂,最大限度增加外泌体的稳定性和活性,并提高其透皮吸收能力,使得治疗效果大大提高的同时,使外泌体形成稳定均一,利于吸收的凝胶状物质,为男性勃起功能障碍的治疗使用提供便利。
[0037] 本实施例的制备方法,采用饥饿人脐带间充质干细胞进行培养的模式,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物,并基于超速离心来进行富集浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体,此外,在人间充质干细胞外泌体中加入药用高分子稳定剂、保湿剂和透皮吸收促进剂,最大限度增加外泌体的稳定性和活性,并提高其透皮吸收能力,使得治疗效果大大提高的同时,使外泌体形成稳定均一,利于吸收的凝胶状物质,为男性勃起功能障碍的治疗使用提供便利。
[0038] 实施例2
本实施例提供了一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,其采用如实施例1的一种干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的制备方法制备得到。每100ml所述干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的组分如下:脐带间充质干细胞外泌体浓缩液50ml、保湿剂(丙二醇和甘油)8ml、透皮吸收促进剂(二甲基亚砜)8ml、药用高分子稳定剂(透明质酸钠)10g、余量为复方电解质注射液。
[0039] 本实施例中,脐带间充质干细胞外泌体浓缩液的外泌体成分具有生物活性,外泌体内的细胞因子(如VEGF和成纤维细胞生长因子)的释放,可促进血管生成,可调节局部组织微环境,改善局部供血,从而达到改善阴茎供血、治疗勃起功能障碍的效果。
[0040] 本实施例还提供了上述干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂的给药方式,通过直接将干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹于阴茎皮肤及龟头处,经皮肤直接吸收进行给药。
[0041] 综上,本实施例的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,其含有浓缩3.5~9倍的脐带间充质干细胞经饥饿培养获得的脐带间充质干细胞外泌体浓缩液,可促进血管生成,调节局部组织微环境,改善局部供血,从而达到改善阴茎供血、治疗勃起功能障碍的效果。
[0042] 下面使用本发明的复方凝胶制剂来进行勃起功能障碍症状的治疗实验,实验过程和实验结果如下。
[0043] 实验例1
患者翟某(37岁),单位中层领导,因工作繁忙、压力大,在一年前出现性欲减退、性生活频率降低,并出现早期的勃起功能障碍症状,治疗前,3个月内性生活频率平均为1次/周,其中3次因阴茎无法正常勃起未完成性生活。4次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态,射精失败。另外6次完成了性交过程,平均时间不足3min。按照《国际勃起功能指数》自测评分为12分,属于轻度勃起功能障碍。
[0044] 患者使用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂治疗(治疗周期为四周),每天在早晨、中午及晚上入睡前清洗阴茎后,取干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹阴茎皮肤及整个龟头,每次涂抹1~2ml后,反复搓揉阴茎皮肤,保证干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂全部被吸收。治疗周期中,患者保持1次/周的性生活频率,期间勃起情况不做统计。治疗四周后停用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,一个月内患者共进行了5次性生活,全部成功完成射精,平均性交时间达到5.4min。请参阅图1,图1所示为翟某治疗前后性生活时间对比图,对比可知,治疗效果明显,差异显著(p<0.01)。这证明了本发明的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,在勃起功能障碍的治疗中,具有显著的疗效。
[0045] 实验例2
患者王某(39岁),糖尿病患病5年以上,性生活频率降低,治疗前,6个月内性生活频率平均为1次/两周,出现明显勃起功能障碍症状。统计6个月的性生活质量,其中3次因阴茎无法正常勃起未完成性生活。6次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态,射精失败。另外5次完成了性交过程,平均时间不足3min。按照《国际勃起功能指数》自测评分为9分,属于中度勃起功能障碍。
[0046] 患者使用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂治疗(治疗周期为四周),每天在早晨、中午及晚上入睡前清洗阴茎后,取干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹阴茎皮肤及整个龟头,每次涂抹1~2ml,反复搓揉阴茎皮肤,保证干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂全部被吸收。治疗周期中,患者发生过两次性生活,期间勃起情况不做统计。治疗四周后停用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,3个月内患者共进行8次性生活,全部成功完成射精,平均性交时间达到5min。请参阅图2,图2所示为王某治疗前后性生活时间对比图,对比可知,治疗效果明显,差异显著(p<0.01)。这证明了本发明的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,在勃起功能障碍的治疗中,具有显著的疗效。
[0047] 实验例3
患者许某(34岁),糖尿病患病1年以上,性生活频率降低,治疗前,4个月内性生活频率平均为1次/周,出现明显勃起功能障碍症状。统计3个月的性生活质量,其中1次因阴茎无法正常勃起未完成性生活。2次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态,射精失败。另外9次完成了性交过程,平均时间不足4min。按照《国际勃起功能指数》自测评分为14分,属于轻度勃起功能障碍。
[0048] 患者使用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂治疗(治疗周期为四周),每天在早晨、中午及晚上入睡前清洗阴茎后,取干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹阴茎皮肤及整个龟头,每次涂抹1~2ml,反复搓揉阴茎皮肤,保证干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂全部被吸收。治疗周期中,患者发生过4次性生活,期间勃起情况不做统计。治疗四周后停用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,2个月内患者共进行10次性生活,全部成功完成射精,平均性交时间达到8min。请参阅图3,图3所示为许某治疗前后性生活时间对比图,对比可知,治疗效果明显,差异显著(p<0.01)。这证明了本发明的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,在勃起功能障碍的治疗中,具有显著的疗效。
[0049] 实验例4
患者田某(36岁),因工作压力大,性生活频率降低,出现勃起功能障碍。治疗前,6个月内性生活频率平均为1次/周。统计6个月的性生活质量,其中4次因阴茎无法正常勃起未完成性生活。6次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态,射精失败。另外14次完成了性交过程,平均时间不足3min。按照《国际勃起功能指数》自测评分为13分,属于轻度勃起功能障碍。
[0050] 患者使用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂治疗(治疗周期为四周),每天在早晨、中午及晚上入睡前清洗阴茎后,取干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂涂抹阴茎皮肤及整个龟头,每次涂抹1~2ml,反复搓揉阴茎皮肤,保证干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂全部被吸收。治疗周期中,患者发生过5次性生活,期间勃起情况不做统计。治疗四周后停用干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,2个月内患者共进行11次性生活,全部成功完成射精,平均性交时间达到7min。请参阅图4,图4所示为田某治疗前后性生活时间对比图,对比可知,治疗效果明显,差异显著(p<0.01)。这证明了本发明的干细胞外泌体浓缩液凝胶制剂,在勃起功能障碍的治疗中,具有显著的疗效。