尊敬的审查员:

本意见陈述是针对国家知识产权局于2021年11月26日发出的关于《一种微环DNA及其制备方法与应用》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。

一、修改说明

将原权利要求1中括号删除,并将对应处的描述方式做修改;

将原权利要求6和7合并成新权利要求6。

以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

具体的修改内容详见权利要求书替换页。

 

二、意见陈述

1)权利要求1具有创造性

本申请权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:具体的制备方法完全不相同。

审查员结合对比文件1~2及本领域惯用手段,驳斥了权利要求1的创造性。对此,申请人拟从以下2个方面说明本申请具有创造性的理由:

本申请的技术路线为:以MN511A-1质粒为基础质粒,通过PCR扩增技术CMV-EGFP-polyA阅读框两侧分别引入lox66lox71位点得到扩增产物一;然后SacIIStuI同时双酶切扩增产物一,连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞得到pYL19完整质粒;再将pYL19完整质粒进行PCR扩增,并引入XmaIPacI酶切位点,得到扩增产物二;再PGK-cre-polyA质粒进行PCR扩增,并引入XmaIPacI酶切位点得到扩增产物三XmaIPacI同时双酶切扩增产物二和扩增产物三,连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞,得到pYL46完整质粒;pYL46完整质粒提取重组质粒,然后将提取的重组质粒瞬时转染至培养状态良好的人胚肾 HEK-293 T细胞

相比之下,对比文件1的技术方案为:通过单链混合加热方式获得两端分别为Spe I和Dra III限制性酶切位点黏性末端的λattR双链。以限制性内切酶Pvu IISpe I分别酶切质粒pPGKPhiC31obpApcDNA3.l(-)-P1A3-TPO;然后pEGFP-N1-attB 质粒的Spe IDra III酶切位点之间插入λattR 片段,在Afl IIIAse I酶切位点之间插入λattL 片段,获得质粒后,在Afl III酶切位点处插入φC31 整合酶表达盒,获得亲本质粒pEGFP-PP,然后限制性内切酶BamH INot I双酶切,去除EGFP后载体自连,并在Nhe I酶切位点处插入hTPO,获得亲本质粒pTPO-PP,同样的方法获得pTPO-C;然后将两种亲本质粒进行重组;重组后转染Hela细胞

一方面,mcDNA的制备主要依赖于同源重组位点及位点特异性重组酶如phiC31、Cre、ParA及BxbI,本申请背景技术中有介绍,因此,这些位点已经是本领域的公知常识,不通过这些位点不能获得mcDNA,这是一项重要基础。但是现有技术或是对比文件1并未启示或者教导如何对表达框、质粒、位点、体内、体外、扩增引物的选择、设计以及进行相应处理进而获得具有较强免疫功能的微环DNA。另一方面,本申请和对比文件1在具体微环DNA的制备方案上存在诸多区别,审查员基本都用“通过常规选择”来对这些区别技术特征加以否定。此外,审查员还认为对比文件2公开了一种将重组酶基因连接到亲本质粒中,经表达后直接对亲本质粒进行切割、重组,高效、快捷地获得微环DNA的方法。因此,在对比文件2的启示下,本领域技术人员有动机将Cre重组酶连接到亲本质粒上,并进一步采用“常规选择”来对本案的区别技术特征进一步加以否定。

申请人不理解的是,正如审查员所说的对比文件1为体外制备微环DNA,对比文件2为体内制备微环DNA,那么两者又怎么能结合到一起去评价本申请的创造性呢?这是申请人不理解的第一点。不理解的第二点是,在本申请和对比文件1、对比文件2的技术内容完全不一致的前提下,如果本案的这些区别技术特征都是常规选择的话,那么所获得的微环DNA的相关性能和应用效果也应该是很普通的。但本申请具体实施例1结合图6表明细胞核中可提取得到pYL46质粒转变得到的mcDNA,且这种mcDNA比质粒pYL19更容易进入细胞核。图7表明,12h,24h,48h不同时间点EGFP的相对表达量pYL46都是pYL46的2倍左右,说明能产生微环的pYL19表达量更高。图8表明pYL46组与pYL19组相比,蛋白表达量提高约2~3倍。实施例2将本申请制备的微环DNA用于抗鸡新城疫病毒,结合图12和图13表明该微环DNA可提供80%的保护率,并且雏鸡肺脏损伤较轻,有望开发成mcDNA疫苗用于鸡只的抗新城疫病毒保护。通过对比文件1和对比文件2关于其微环DNA功效上的描述,至少没有用作抗鸡新城疫病毒产品的介绍。

综上所述,本申请的技术方案较比对比文件、对比文件2结合常规技术手段具有突出的实质性特点和显著进步。

2)关于权利要求2~6的创造性

权利要求2~3为权利要求1的从属权利要求,在其引用的主权具备创造性的前提下,其从权也具备创造性,权利要求1的创造性如前所述。

权利要求4保护的是权利要求1~3任意一项所述的制备方法获得的微环DNA,在权利要求1~3具备创造性的前提下,权利要求4也具备创造性。

权利要求5为权利要求4的从属权利要求,在权利要求4具备创造性的前提下,权利要求5也具备创造性。

权利要求6保护的是权利要求4或5所述微环DNA或权利要求1~3任意一项所述微环DNA的制备方法获得的微环DNA在制备抗鸡新城疫病毒细菌制剂中的应用方法。审查员进一步举出了对比文件3,但其公开日期是2019年7月1日,本申请的申请日是2018年11月26日,公开日在2019年3月29日,该对比文件无法评价本申请的新创性。

综上所述,本申请的权利要求1~6不属于现有技术,与对比文件1~2结合公知常识相比,是基于不同的发明构思,采用不同具体方案进行的发明,且技术效果也比现有技术更显著。对比文件1~2的综合方案不足以对本申请的方案构成显而易见的启示,也不能获得本申请的技术效果。故本申请权利要求1~6的技术方案相较与对比文件1~2具有实质性特征和显著性进步,具备专利法22条3款所规定和创造性。

如果审查员在后续审查过程中认为本申请还存在其他缺陷,请给申请人提供修改和陈述意见的机会,申请人将尽力配合审查员的工作,谢谢审查员。