尊敬的国家知识产权局:

申请人收到了国家知识产权局对申请号为201811395084.8发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动,申请人仔细阅读了审查意见通知书正文,按通知书的要求进行了修改,申请人提出以下意见,希望和审查员商榷:

一、修改说明:

1、将权利要求2-7中的附加技术特征加入到权利要求1中,形成新的权利要求1

2、删除权利要求2-7,并相应的修改其他权利要求的编号和引用关系,详见修改后的权利要求书。

以上修改没有超出原权利要求书和说明书的范围。详见修改后的权利要求书。

二、关于修改后的权利要求1创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于:

所述步骤1中的干燥温度为50℃以下,筛目数为15-20目;

所述步骤2中的黄芪粉末与溶剂的质量体积比(g/mL)为16-112;提取转速为600-800/分钟,提取时间为6-10小时,提取次数1-3次;所述步骤4中的超声振荡的时间为25-35分钟;

所述步骤4中的黄芪提取物与油脂的质量比为1:20-7:20

所述步骤4中的溶有油脂的黄芪提取物占基础饲料的1.00-7.00g/kg

所述步骤4中的溶有油脂的黄芪提取物占基础饲料的3.00-7.00g/kg

基于上述区别技术特征,由表2及图7-8可知,本发明制备得到的基于黄芪提取物的鱼饲料提高了摄食量(82.30 g /尾)和饲料效率(高达55.76%),增重高达45.27 g/,即:提高了获得率、降低了提取过程中的活性损失、降低了生产成本,更有利于在饲料中使用。

对比文件1没有公开上述区别技术特征,二者目的不同,因此出发点不同。且没有达到“基于黄芪提取物的鱼饲料提高了摄食量(82.30 g /尾)和饲料效率(高达55.76%),增重高达45.27 g/”的技术效果。

对比文件2 (CN108094766A) 添加了黄芪微波蒸馏粗提物、黄芪乙醚粗提物、双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂;而本申请添加的是黄芪丙酮提取物;是将黄芪总黄酮提取物与油脂相混合得到鱼饲料;其中,黄芪总黄酮提取物与黄芪微波蒸馏粗提物、黄芪乙醚粗提物不同;双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂与油脂完全不同,即本申请与对比文件2所用到的成分完全不同;二者存在本质的区别。对比文件2无论黄芪微波蒸馏粗提物还是黄芪乙醚粗提物都是黄芪含有的极性较小的物质,而本申请的黄芪丙酮提取物是黄芪含有的极性较大的物质,前者还含有复合益生菌,二者在物质种类上有显著不同。

对比文件2的目的是提高鲤鱼的免疫力和抗病力,加快鲤鱼生长速度;而本申请基于黄芪提取物的鱼饲料提高了摄食量(82.30 g /尾)和饲料效率(高达55.76%),增重高达45.27 g/尾;因此,本申请相对于对比文件2具有预料不到的技术效果。

对比文件3 (CN 1066673A)公开了用金钱草提取物作为天然抗氧化剂的方法;并表述此方法可用于含油脂的饲料。首先金钱草并非黄芪,二者存在巨大的差异。金钱草为报春花科珍珠菜属植物,主要利用地上部分;而黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪属,主要利用其根部。且对比文件3也没有公开上述的“基于黄芪提取物的鱼饲料提高了摄食量(82.30 g /尾)和饲料效率(高达55.76%),增重高达45.27 g/”的技术效果,因此,本申请相对于对比文件3具有预料不到的技术效果。

审查意见里指出:对比文件1已经公开了可以用丙酮提取黄芪,虽然后续还经过了过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换等复杂的过程,但是其目的主要是纯化,如果基于简化操作、使用目的的考虑,可常规选择是否进行后续的纯化。况且,在本领域,中药人用、饲用均是常规的,因此,当选择饲用时,基于成本的考虑,可舍去上述复杂的纯化过程

申请人并不这样认为,申请人认为:首先,第一,从技术效果上看,对比文件1进行了‘过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换、再解析、洗脱’等复杂的过程。此提取方法繁琐且获得率低,获得物价格昂贵,并不适合饲料利用。而本申请中获得黄芪提取物的提取工艺简单,是针对获得最佳抗饲料氧化效果的提取质量而设立的简化方法,提高了获得率、降低了提取过程中的活性损失和生产成本,更有利于在饲料中使用。第二,对比文件1可能使用丙酮进行溶剂提取,但其后又进行了复杂的除杂步骤,最终获得的物质是经过纯化的黄酮类物质。而本申请仅用了丙酮等溶剂进行提取,获得了黄芪丙酮等提取物。从整体工艺来看二者差别巨大,选用丙酮作为溶剂是基于黄芪不同极性提取物对饲料的抗氧化效果的筛选实验,而不是根据对比文件1的方法。本申请的前提和目的是为了克服目前黄芪提取物在生产中普遍存在弊端,使其更利于在饲料中使用,而经过本实验室的创造性地劳动、努力研发获得的方法。其次,审查意见里指出:当选择饲用时,基于成本的考虑,可舍去上述复杂的纯化过程,但是,第一,现有技术中并没有省去“过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换、再解析、洗脱”这些步骤还能够保证黄芪提取物的提取效率和药用效果第二,若审查员坚持认为现有技术能够省去这些步骤,还能够到达本申请的技术效果,敬请审查员举证

审查意见里指出:本领域已知黄芪能显著提高细胞免疫功能,有抗氧化作用;黄芪中富含多种有效成分,例如蒙古黄芪中经分析 鉴定有176种化合物,即糖、有机酸、多酚类、黄酮、菇类等(参见“山西省“两区”开发农业产业化科技 指南“,张吉科,等,山西经济出版社,第223页,2008. 12),可见,黄芪中含有抗氧化的多酚;黄芪属豆 科植物,豆科植物中的异黄酮还有雌性激素,抗氧化和溶血以及抗胆固醇和血脂,抑菌,抑酶等活性(参见 对比文件1),即对比文件1已经公开了黄芪异黄酮具有抗氧化作用,关于黄芪中的异黄酮能抗氧化也有多篇现有技术记载,在此不作赘述。由于丙酮的极性能广泛的提取得到黄酮类、多酚类等,即黄芪及其提取物中含有抗氧化成分如异黄酮、多酚等是根据对比文件1和现有书籍的教导不难获知的,因此,不需要额外的数据证实,在用丙酮提取黄芪后,提取物具有抗氧化作用是不难预期的。申请人提供的两篇文献中指明黄酮类具有促氧化作用,但是并没有指明是黄芪的黄酮类是促氧化的,并不能直接说明和本申请的抗氧化是相反的启示。

申请人并不这样认为,申请人认为:在所含物质方面,第一,黄芪属豆科植物含有异黄酮,同时也含有其他多酚类物质和黄酮类。已有报道显示这些物质具有抗氧化性质。然而正如对比文件1所表示的这些物质‘种类很多(自然界已鉴定出的黄酮类化合物达8 000多个),在不同植物中含量不等、结构不同、生物活性也不相同’。已有报道显示,这些物质具有促氧化性。黄芪黄酮中包括黄芩苷、槲皮素、山萘酚、异槲皮苷等物质, 其母核均为 5-羟基黄酮;以及一些其他类型的黄酮, 如二氢黄酮、二氢异黄酮和查尔酮等[参考文献:苏优拉,陈贵林. 黄芪中黄酮类成分的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报,2021年,第12卷第3]。黄芪还含有黄芪皂苷、大豆皂苷、异黄酮、异黄烷等[参考文献:《中药学》]

第二,已有的报道显示,大部分黄酮类化合物特别是高浓度时,均具有明显的促氧化作用。槲皮素(quereetin)作为黄酮类化合物的代表物质,能促进超氧阴离子和过氧化氢自由基的产生,导致活性酶SH-基团的氧化,能显著抑制胰腺β细胞的增殖,具有显著促氧化作用。山柰酚能导致细胞内产生的ROS 明显增加,具有显著的促氧化和细胞毒性。黄芩苷(baicalin)能导致氧自由基的产生和细胞凋亡,具有显著促氧化作用。在一般的情况下,促氧化作用较强的黄酮类化合物依次为:黄酮醇、黄酮、黄烷醇、黄烷酮。黄酮醇中促氧化作用较强的化合物主要有:槲皮素,杨梅酮、桑色素、山柰酚、3-羟基黄酮、非瑟酮、高良姜素(galangin);黄酮为:芹菜素、木犀草素、白杨素、芦丁、黄芩素(baicalein)、黄芩苷、金合欢素;黄烷醇为:二氢槲皮素;黄烷酮为:柚皮素,橙皮素、圣草酚,柚皮苷[参考文献:龚金炎,等. 黄酮类化合物的促氧化作用及其细胞毒性研究进展[J]. 中草药,2008年第39卷第12期;代永刚. 黄酮类化合物促进氧化作用的研究[J]. 中国食品添加剂,文章编号:1006-2513(2007)01-0070-03SAHU S CGRAY G C. Prooxidant activity of flavonoids:effects on glutathione and glutathione S-transferase in isolated rat liver nuclei[J]. Cancer Letters1996104(2) : 196-196.]

第三,异黄酮是天然存在于豆科植物中的黄酮类化合物。报道显示,异黄酮在一些条件下能表现出促氧化特性;能通过促进脂氧合酶所介导的活性氧诱导骨骼肌细胞发生促氧化[参考文献:陈伟,等.4-30异黄酮通过促进脂氧合酶所介导的活性氧诱导骨骼肌细胞发生促氧化[J].畜牧与兽医,2014年,第46197-198.]。陈伟等(2012)报道异黄酮在低浓度条件下发挥抗氧化作用,在高浓度条件下却表现促氧化作用,导致过氧化氢的含量明显增加、DNA损伤、细胞死亡率提高[参考文献:陈伟,等.一些抗氧化剂的抗/促氧化作用及其机制[J].动物营养学报,201224(4): 595-605NORIYUKI KPOCAS E STOUZA N Aet al. Isoflavone decreases the free sulfydryl groups present in the enzyme and its inhibitory effect on enzyme activity[J]. Bioorganic Medicinal Chemistry200816 (19) : 8801-8805]。

第四,黄芪也含有多酚类化合物。但已有报道显示,植物源食物中酚类化合物也具有促氧化作用[参考文献:汪曙晖,等.天然抗氧化剂的抗氧化与促氧化作用[J].中国食物与营养,201622( 8): 68-71;郑丽芳.酚类抗氧化剂的结构修饰和促氧化机制研究[D]. 兰州:兰州大学]。作为酚类物质的基本构件儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯在一定条件下能提高活性氧自由基的产生,起到促氧化作用[参考文献:Tian J, Geiss C, Zarse K, Madreiter-Sokolowski CT, Ristow M. Green tea catechins EGCG and ECG enhance the fitness and lifespan of Caenorhabditis elegans by complex I inhibition[J].Aging (Albany NY)202113:22629-22648.]

第五,作为黄芪黄酮成分的大豆皂苷也被证实具有促氧化作用[参考文献:CHOIA E JCHEEA K MLEEB B H. The prooxidantrather than antioxidantacts of daidzein in vivo and in vitro: daidzein suppresses glutathione metabolism[J]. European Journal of Pharmacology2006542(3) : 162-169.]

第六,一般认为普通物质的基本功能为‘有正效应、无效应、有反效应’。在众多的多酚或黄酮类物质中,无效的物质一定是存在的。当前已有的报道证实黄芪提取物具有‘正效应、无效应、反效应’的基本功能属性,因此已有的报道并不能给科研人员提供选择的倾向。

在抗氧化方面,第一,关于黄芪提取物所含的黄酮或多酚类物质的报道多为其对氧自由基的清除作用上、而产生的抗氧化作用,但并没有其抗饲料氧化的报道;而本申请公开了黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用。自由基和饲料是2种不同的物质。饲料中含有蛋白、脂类、糖类、维生素和矿物质等。饲料的多种原料经过必要的混合、调制和加工之后,其形态和性质与起初的原料相比发生了显著的变化,产生了本质的区别,使其成为了一种复杂的混合物而非纯合物。饲料中的许多物质可能被氧化,但也有可能抗氧化,氧化物质和抗氧化物质之间会发生复杂的相互作用,但最终表现出来的结果并不能由其中某个成分来判断;饲料中的不同物质的氧化机制不同,混合后的氧化机制也会发生复杂的变化,其结果需要参考多种因素的作用。最为可信和可靠的依据应该是饲料本身做为对象所表现出来的实际结果,而不是依据对自由基作用的推测。抗氧化物质对自由基的作用,只能说明其对自由基本身的作用,而不能说明其对饲料氧化的作用。对比文件中并无黄芪、黄芪提取物、黄芪的黄酮类等物质抗饲料氧化的实验数据,也无相关文献引用。对比文件也未阐述异黄酮、黄酮类或多酚类对饲料氧化的作用,也没有证据表明其可以抗饲料氧化。对比文件1所述的黄芪提取物是一种黄酮类物质的纯化物。而本申请的黄芪提取物是一种粗提物,此差别自然会让人想到本申请的提取物达不到对比文件1抗氧化的效果。而且本申请的提取方法与对比文件1涉及的方法区别很大,因此从此方面来说,对比文件1也不具有参考价值。

第二,世间的几乎所有物质在不同的条件下都能表现为‘氧化性’和‘抗氧化性’2种状态;几乎所有的生物机能都能归结为‘氧化还原(抗氧化)反应’。依此推断所有物质都具有抗氧化性。但事实上并不是所有物质都能起到真正的抗氧化作用,只有很少的物质能作为抗氧化剂被人类利用。同样的道理,植物材料中普遍存在多酚或黄酮类等物质,可能对自由基有一定的清除作用,但其中实际具有抗食品或饲料氧化的的植物材料则极其有限,往往必需从大量的植物材料中筛选出为数不多有实际价值的材料。我们前期对20多种植物进行了饲料抗氧化筛选,有效的也仅有4-5种而已。因此,本领域技术人员不经过创造性地劳动是无法获得现实的结果的。

第三,本申请公开了黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用,而且提高了鱼的摄食量和增重率,并确定了其在饲料中的最佳添加量。而对比文件没有饲料氧化、对鱼生长和摄食方面的数据、陈述和文献证据。黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用,因此在饲料中不用添加合成抗氧化剂。目前在饲料工业中使用较多的抗氧化剂主要是合成抗氧化剂,包括乙氧基喹啉 (EQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等。但已有报道显示,这些抗氧化剂对动物具有致癌和遗传毒性,而且会导致其在鱼肉制品内的残留和富集,造成食品安全隐患危及人体健康。本申请克服了饲料添加合成抗氧化剂行业普遍存在的弊端。以上也是本申请的突出特点与显著进步。

审查意见里指出:本申请的背景技术部分多出记载了,鱼饲料中的油脂含量高,极易氧化等,附图中也表明了黄黄提 取物的抗亚麻酸氧化、抗亚油酸氧化等效果,可见,本申请的目的也是为了防止饲料中的油脂氧化。对比文 3公开了经抗氧化筛选试验,发现金钱草提取物对防止食用油脂、含油脂食品和含油脂饲料的酸败有很好的效果(参见对比文件3的第5页的第1-2段),可见,对于含油脂饲料具有抗氧化作用并不是推测,虽然对 比文件3是金钱草,但是其给出了将具有抗氧化功能的中药提取物添加到含油脂的饲料中,以防止其氧化、酸败的技术启示。因此,在上述对比文件2-3的启示下,所属技术领域的技术人员有动机对对比文件1的技 术方案进行改进,将具有抗氧化功能的黄黄提取物用于制备鱼饲料,以扩大黄黄的应用范围,并防止饲料的 品质劣化。

申请人并不这样认为,申请人认为:第一,对比文件3公开了金钱草提取物作为天然抗氧化剂的方法,并表述此方法可用于含油脂的饲料。首先金钱草属于中草药,但有记载的中草药植物有上千种,金钱草不能代表所有中草药;金钱草提取物具有抗氧化作用,但并不能依次说明所有中草药提取物都具有抗氧化作用。黄芪属于中草药,但与金钱草存在巨大的差异。金钱草为报春花科珍珠菜属植物,主要利用地上部分;而黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪属,主要利用其根部。

第二,从对比文件3的文中表述可见,金钱草主要用于食用油脂的抗氧化,将其用于饲料是一种推测。文中表述此方法可用于含油脂的饲料,但并无金钱草提取物作为饲料抗氧化剂的实验数据,也无相关实施例和文献引用。其阐述的并非金钱草提取物对饲料本身氧化的作用,而是其对食用油脂的作用。即金钱草提取物能抗食用油脂的氧化,但并没有证据表明其可以抗饲料氧化,更不能说明黄芪提取物有相同的作用。

第三,由于合成抗氧化剂乙氧基喹啉、BHTBHA对食品存在安全隐患[https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_18159.htm]20172月,欧盟公布:停止在动物饲料中添加使用乙氧基奎琳(2017年第G/SPS/EU/190公告)[http://news.feedtrade.com.cn/ 2017-04-11 12:58:36]。部分国家规定禁止食用添加合成抗氧化剂饲料喂养的动物内脏;美国规定乙氧基奎琳在宠物饲料中的浓度不能超过75PPM[参考文献:Błaszczyk A, Augustyniak A, Skolimowski J. Ethoxyquin: an antioxidant used in animal feed (乙氧基奎琳:一种动物饲料抗氧化剂)[J]. Int J Food Sci (国际食品科学杂志), 2013, 2013:1-12.]。因此这些合成抗氧化剂的弊端将导致市场对天然来源的抗氧化剂的需求提高;从人体健康和市场需求考虑,开发新型天然的饲料抗氧化剂具有重要意义。

第四,当前我国已规定,自202011日起,退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,不许生产,原批号作废[中华人民共和国农业农村部194号公告],并对天然植物为原料的提取物申报新饲料添加剂,适当放宽其分析检测和评价材料要求[中华人民共和国农业农村部226号公告和227号公告],并加快制定《饲料原料目录》中天然植物为原料的新饲料添加剂注册简化规则[中华人民共和国农业农村部 农办议[2020]435],鼓励天然植物提取物饲料添加剂的开发。黄芪属于饲料原料,属我国大宗中草药之一,资源丰富,但每年大量的黄芪采收和加工副产物利用十分有限。利用提取工艺获得黄芪有效成分,开发其饲料利用价值,增加其新用途,改善其传统的利用结构,发挥其综合利用潜力,提高其经济和社会效益,具有十分重要的意义。

第五,如果仅以金钱草提取物的专利报道,作为所有中草药申请的对比文件,将大大阻碍中草药来源的新型天然饲料抗氧化剂的开发,有违国家政策鼓励天然饲料添加剂开发的思想。

且上述区别技术特征也不是本领域的公知常识,因此,修改后的权利要求1相对于对比文件1-3以及公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。

三、关于修改后权利要求2的创造性

修改后权利要求2与修改后的权利要求1具有单一性,在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,修改后权利要求2也必然具有创造性。

综上所述,本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。如有问题,望及时联系申请人或代理人,给予再次答复的机会,联系电话:13551134124

请审查员继续审查。

 

                               申请人:内江师范学院

                                  20220501