1.
一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物,其特征在于,包括上游引物NeV F、下游引物NeV R,其中,上游引物NeV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物NeV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2、一种非诊断目的地检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法,其特征在于,包括以下步骤:
提取待检测样品的RNA,以待检测样品的RNA为模板,反转录得到cDNA,用权利要求 1中所述的引物和SYBR Green对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增;通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取,判断S型扩增曲线和荧光强度值,在扩增曲线正常的情况下,若荧光强度值超过阈值时,则记为阳性,则该待检测样品含有Nebovirus病毒,若荧光强度值低于阈值时,则记为阴性,则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。
3、根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述反转录的步骤为:将RNA模板4 µL、1号5×Prime Script Buffer 4 µL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix
1 μL、4号Random 6 mers 2 µL和5号RNase Free dH2O
9 μL混匀,放入PCR仪上进行反转录。
4、根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。
5、根据权利要求2所述的方法,其特征在于,荧光定量PCR反应检测体系为:TB Green Premix Ex Taq
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μL,上游引物NeV F、下游引物NeV R各1.0 μL,cDNA模板100 ng,用ddH2O补齐到20 μL。
6、根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2 min;PCR: 95℃反应15 sec,51℃反应20 sec进行40个循环。
7、权利要求1所述的检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物在制备Nebovirus快速诊断试剂盒中的应用。