尊敬的国家知识产权局:
申请人收到了国家知识产权局对申请号为201811395084.8发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动,申请人仔细阅读了审查意见通知书正文,按通知书的要求进行了修改,申请人提出以下主动修改,希望和审查员商榷:
一、修改说明:
1、将“所述步骤4中的溶有油脂的黄芪提取物占基础饲料的1.00-7.00g/kg”删除。
2、将权利要求3的编号修改为2,并将引用关系修改为1。
以上修改没有超出原权利要求书和说明书的范围。详见修改后的权利要求书。
二、关于修改后的权利要求1创造性
修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于:
所述步骤4中的溶有油脂的黄芪提取物占基础饲料的3.00-7.00g/kg。
基于上述区别技术特征,其中,黄芪提取物活性成分的筛选或占基础饲料比重的确定过程如下:
一、筛选实验
自2014年9月至2018年7月,本课题组先后对益母草、银杏叶、三角梅、藿香蓟、当归、石榴皮、黄芪、芦荟皮、桑叶、野甘草、补骨脂、苍术、川芎、姜黄、蒲公英、乌梅、诃子、紫苏叶、丹参、山楂、楮叶、野菊花、杜仲23种植物提取物进行了体外的饲料抗氧化筛选。
方法:
先对不同植物进行不同极性溶剂的提取,溶剂一般为石油醚(低极性)、乙酸乙酯(中极性)、乙醇或丙酮(高极性)和水(大极性),获得4种不同极性的提取物。然后按1-3克/千克的浓度添加到不饱和脂肪酸(比如亚油酸、亚麻酸或者鱼油)和饲料中,同时设置空白组(即不添加提取物组)。筛选实验一般采用快速氧化法(如金属诱导或高温处理),测定指标为反应体系内的过氧化物(PO)、共轭二烯(CD)和丙二醛(MDA)的含量,依此确定每个植物的抗氧化最佳的极性提取物。对于最佳的提取物再通过在饲料中添加不同的浓度(一般为0-9克/千克)进一步验证其效果和确定其最佳添加量,一般采用的方法为自然氧化法,即在自然保存条件下20-28℃存放2个月后测定指标。对于效果较好的提取物,再进行投喂实验,确定其对养殖效果的影响。
结果:
1.
与空白组相比,三角梅、补骨脂、苍术、乌梅、诃子、紫苏叶、山楂、楮叶对饲料的抗氧化作用均低于空白组,因此判断其对饲料具有促氧化效果。
2.
与空白组相比,益母草、石榴皮、芦荟皮、川芎、蒲公英、野菊花、杜仲对饲料的抗氧化效果与空白组无显著差异,因此判断其对饲料抗氧化无效。
3.
与空白组相比,丹参、藿香蓟、野甘草提取物对饲料的抗氧化作用虽高于空白组但差别较小,综合考虑其获得率和添加成本,决定放弃对其进一步研究。
4.
与空白组相比,当归、银杏叶、黄芪、桑叶、姜黄提取物对饲料的抗氧化作用显著高于空白组,而且其获得率和添加成本较低,但姜黄提取物在饲料中的应用报道较多,因此判断银杏叶、当归、黄芪、桑叶有进一步研发的价值。
Ø 有关黄芪提取物对饲料抗氧化的影响表现见本申请书。
Ø 有关当归提取物对饲料抗氧化的影响表现如下:
图1 不同极性当归提取物抗亚油酸氧化的效果。当归乙酸乙酯提取物的效果最好。
注:图中所示数据为添加不同极性提取物的亚油酸乳化液中PO、CD和MDA含量占空白亚油酸乳化液中的百分比,以平均数±标准差(n=3)表示;在同一列数据中,上标字母不同者表示数据间差异显著,相同者表示差异不显著。
图2不同极性当归提取物抗亚麻酸氧化的效果。当归乙酸乙酯提取物的效果最好。
注:图中所示数据为添加不同极性提取物的亚麻酸乳化液中PO、CD和MDA含量占空白亚麻酸乳化液中的百分比,以平均数±标准差(n=3)表示;在同一列数据中,上标字母不同者表示数据间差异显著,相同者表示差异不显著。
图3不同极性当归提取物抗鱼饲料氧化的效果。当归乙酸乙酯提取物的效果最好。
注:图中所示数据为添加不同极性提取物的饲料中PO、CD和MDA含量占空白饲料中的百分比,以平均数±标准差(n=3)表示;在同一列数据中,上标字母不同者表示数据间差异显著,相同者表示差异不显著。
图4不同浓度当归乙酸乙酯提取物抗鱼饲料氧化的效果(通过折线回归,确定其最佳添加量)。当归乙酸乙酯提取物在5.91 g/kg 以上浓度的效果最好。
A
B
C
注:图中所示数据为添加不同浓度当归乙酸乙酯提取物的饲料中PO、CD和MDA含量占空白饲料中的百分比,以平均数±标准差(n=3)表示。
图5当归乙酸乙酯提取物气相色谱与质谱联用检测色谱图。有三个主峰。
表1
当归乙酸乙酯提取物气相色谱与质谱联用法检出物质。三个主峰均为藁本内酯衍生物。
注:本检查重复了3次,结果相同。
表2投喂含不同浓度当归乙酸乙酯提取物的饲料60天,对鱼生长、摄食量和饲料效率的影响。当归乙酸乙酯提取物提高了鱼的生长、摄食量和饲料效率。
注:表中数据以4个重复的平均数±标准差表示,每个重复包含20尾鱼;在同一列数据中,上标字母不同者表示数据间差异显著,相同者表示差异不显著。
图6投喂含不同浓度当归乙酸乙酯提取物的饲料60天后,建鲤摄食量折线回归分析。当归乙酸乙酯提取物诱食的最佳添加量为3.59 g/kg饲料。
注:图中数据以4个重复的平均数±标准差表示,每个重复包含20尾鱼。
图7投喂含不同浓度当归乙酸乙酯提取物的饲料60天后,建鲤增重折线回归分析。当归乙酸乙酯提取物促生长的最佳添加量为3.52 g/kg饲料。
注:图中数据以4个重复的平均数±标准差表示,每个重复包含20尾鱼。
Ø 有关银杏叶提取物对饲料抗氧化的影响表现如下:
图1不同极性银杏叶提取物抗亚油酸氧化的效果。银杏叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
图2 不同极性银杏叶提取物抗亚麻酸氧化的效果。银杏叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
图3 不同极性银杏叶提取物抗鱼饲料氧化的效果。银杏叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
图4 不同浓度银杏叶乙酸乙酯提取物抗鱼饲料氧化的折线回归分析。确定银杏叶乙酸乙酯提取物在4.31 g kg-1浓度的效果最好。
图5 银杏叶各提取物的抗氧化效果与其黄酮类含量的关系。
表1投喂含不同浓度银杏叶乙酸乙酯提取物的饲料60天,对鱼生长、摄食量和饲料效率的影响。银杏叶乙酸乙酯提取物提高了鱼的生长、摄食量和饲料效率。
图6 投喂含不同浓度银杏叶乙酸乙酯提取物的饲料60天后,建鲤摄食量回归分析。确定银杏叶乙酸乙酯提取物提高摄食的最佳添加量为2.60 g/kg饲料。
图7 投喂含不同浓度银杏叶乙酸乙酯提取物的饲料60天后,建鲤增重回归分析。确定银杏叶乙酸乙酯提取物提高生长的最佳添加量为2.31 g/kg饲料。
Ø 有关桑叶提取物对饲料抗氧化的影响表现如下:
图1不同极性桑叶提取物抗亚油酸氧化的效果。桑叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
数据表示为3个重复的平均数 ± 标准差;在同一指标内,柱标字母不同者表示数据间差异显著,相同者表示差异不显著(P < 0.05)。下同。
图2不同极性桑叶提取物抗亚麻酸氧化的效果。桑叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
图3不同极性桑叶提取物抗鱼饲料氧化的效果。桑叶乙酸乙酯提取物的效果最好。
图4不同浓度桑叶乙酸乙酯提取物抗鱼饲料氧化的折线回归分析。确定桑叶乙酸乙酯提取物在4.90 g/kg 浓度的效果最好。
A
数据表示为3个重复的平均数 ± 标准差。下同。
B
C
图5桑叶各提取物的抗氧化效果与其多酚类含量的关系。
表1投喂含不同浓度桑叶乙酸乙酯提取物的饲料60天,对鲫鱼生长、摄食量和饲料效率的影响。桑叶乙酸乙酯提取物提高了鱼的生长、摄食量和饲料效率。
数据表示为4个重复的平均数 ± 标准差,每个重复20尾鱼。在同一列中数据标注字母不同者表示差异显著,相同者表示差异不显著(P < 0.05)。
增重
= 末重 - 初重;饲料效率 = 100 × 增重/摄食量
图6投喂含不同浓度桑叶乙酸乙酯提取物的饲料60天后,鲫鱼摄食量回归分析。确定桑叶乙酸乙酯提取物提高摄食的最佳添加量为4.11
g/kg饲料。
图7投喂含不同浓度桑叶乙酸乙酯提取物的饲料60天后,鲫鱼增重量回归分析。确定桑叶乙酸乙酯提取物提高生长的最佳添加量为3.97
g/kg饲料。
二、抗氧化和促生长效果对比
1、本申请公开了在最佳添加浓度下(0.6%),黄芪丙酮提取物对饲料氧化的抑制率可达60%(见图4-6)。Chen等(2013)报道,合成食品抗氧化剂:丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)在0.02%浓度下对葵花籽油的氧化分别能产生24.8%、41.2%和92.6%的抑制率[1]。Thorisson、Gunstonea和Hardy(1992)报道,常用饲料抗氧化剂乙氧基奎琳(EQ)在0.1-0.5%浓度下能对不同种类鱼油的氧化能产生81.6%至97.0%的抑制率[2]。而且,已有报道显示,在大豆油中BHT和银杏黄酮(含量55%)对大豆油氧化的抑制率约为50%;对鼠脑组织匀浆脂质氧化的抑制率约为65%[3]。虽然油脂和饲料区别很大,但这些数据能说明黄芪丙酮提取物的抗氧化能力接近或者不低于合成抗氧剂的水平。
2、迷迭香提取物是近年来开发的一种效果优良的天然食品抗氧化剂。据报道,在0.02%浓度下其对葵花籽油的氧化抑制率可达72%[1];在0.04%浓度下其对大豆油的氧化抑制率为45%[4];在0.05%浓度下其对FeSO4诱导亚油酸氧化的抑制率为55%[5]。对比可见,黄芪丙酮提取物抗脂质氧化的效果并不比迷迭香提取物差,虽然其添加量高于迷迭香提取物。但迷迭香提取物和银杏黄酮(含量55%)一样提取工艺复杂,提取成本较高而且获得率低。据报道迷迭香提取物提取获得率仅为1.75%,银杏黄酮的提取获得率也不超过2%[1,3]。而本申请中使用的粗提取法,仅需丙酮一步提取,提取工艺简单,提取成本很低,而且获得率高(可达11%是前者的6倍)。而且本申请使用的黄芪,主要为黄芪采收和加工过程中产生的废弃物或者副产物,能进一步降低生产成本。宋振帅等(2014)报道,八角、丹参和生姜3 种植物添加量为2%时,对配合饲料的抗氧化抑制率为22.6-26.3%;添加4%时,对配合饲料的抗氧化抑制率为34.1-36.4%[6]。对比可见,即使提高数倍的浓度,八角、丹参和生姜对配合饲料的抗氧化效果也远低于本申请的黄芪丙酮提取物。综合以上数据可知,无论与化学合成抗氧化剂或天然抗氧化剂相比,黄芪丙酮提取物在饲料抗氧化效果、生产工艺和成本上都存在优势。
3、而且本申请公开了黄芪丙酮提取物提高了鱼的增重和摄食量。本申请数据显示,饲料添加0.6%黄芪丙酮提取物提高了鲤鱼44.5%的增重(见表2)。喹乙醇(目前已禁用)、大蒜素、黄霉素是水产饲料中常用的化学合成促生长剂,也是行业公认的最有效促生长剂[7]。已有的报道显示,100ppm和125ppm的喹乙醇分别提高了草鱼和罗非鱼幼鱼12.6%和13.6%的增重[8];15mg/kg大蒜素和8mg/kg黄霉素分别提高了虹鳟10.35%和12.62%的增重[9]。以上数据说明黄芪丙酮提取物对鱼的促生长效果在同行业中处于前列,甚至能超过合成促生长剂的效果。虽然黄芪丙酮提取物在饲料中的添加量比化学合成促生长剂的高,但作为天然来源的促生长剂,具有无残留、无毒副作用、不污染环境的优势。而且饲料中添加0.6%黄芪丙酮提取物提高了鲤鱼51.7%的摄食量;在行业同类产品中对比,其表现也非常突出和优秀,这也是本申请的突出进步。
综上所述,黄芪丙酮提取物简单独特的提取技术,较高的提取获得率,较低的生产成本,以及优良的抗氧化和促生长效果,使其在饲料中应用成为可能,是对现有技术的巨大改进,是其在应用上质的飞跃。本申请公开的技术方案开创了黄芪提取物在鱼饲料中作为抗氧化剂和促生长剂的应用。
参考文献:
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compared with synthetic antioxidants (迷迭香提取物与合成抗氧化剂对葵花籽油的抗氧化作用比较)[J].
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[2]Thorisson S,
Gunstonea F, Hardy R. The antioxidant properties of ethoxyquin and of some of
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由本发明表2可知,本发明制备得到的基于黄芪提取物的鱼饲料提高了鲤鱼51.7%的摄食量和44.5%的增重。对比文件1没有公开上述区别技术特征,且没有达到本申请的上述技术效果。
对比文件2 (CN108094766A) 添加剂包含了黄芪微波蒸馏粗提物、黄芪乙醚粗提物、双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂,是一种复合物;而本申请仅添加了黄芪提取物中的一种丙酮提取物得到的鱼饲料;其中,黄芪丙酮提取物与黄芪微波蒸馏粗提物、黄芪乙醚粗提物在物质成分上有显著不同;与双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂完全不同,存在本质的区别。对比文件2无论黄芪微波蒸馏粗提物还是黄芪乙醚粗提物其成分是黄芪含有的极性较小的物质,而本申请的黄芪丙酮提取物是黄芪含有的极性较大的物质。同时,对比文件2含黄芪提取物的复合物提高了鱼的免疫力和抗病力,加快了鱼的生长,说明了对比文件2的组合物的功能,但并没有说明黄芪提取物(其单一组分)具有同样的功能,即并不能说明‘黄芪提取物’具有促鱼生长的作用。而本申请基于黄芪丙酮提取物的鱼饲料提高了鲤鱼51.7%的摄食量和44.5%的增重,对于对比文件2而言具有预料不到的技术效果。
对比文件3 (CN1066673A)公开了用金钱草提取物作为天然抗氧化剂的方法;并表述此方法可用于含油脂的饲料。首先金钱草并非黄芪,二者存在巨大的差异。金钱草为报春花科珍珠菜属植物,主要利用地上部分;而黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪属,主要利用其根部。且对比文件3也没有公开上述的“基于黄芪提取物的鱼饲料提高了鲤鱼51.7%的摄食量和44.5%的增重”的技术效果,因此,本申请相对于对比文件3也具有预料不到的技术效果。
审查意见里指出:对比文件1已经公开了可以用丙酮提取黄芪,虽然后续还经过了过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换等复杂的过程,但是其目的主要是纯化,如果基于简化操作、使用目的的考虑,可常规选择是否进行后续的纯化。况且,在本领域,中药人用、饲用均是常规的,因此,当选择饲用时,基于成本的考虑,可舍去上述复杂的纯化过程。
申请人认为:首先,第一,从技术效果上看,对比文件1进行了‘过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换、再解析、洗脱’等复杂的过程。此提取方法繁琐且获得率低,获得物价格昂贵,并不适合饲料利用。而本申请中获得黄芪提取物的提取工艺简单,是针对获得最佳抗饲料氧化效果的提取质量而设立的简化方法,提高了获得率、降低了提取过程中的活性损失和生产成本,更有利于在饲料中使用。第二,对比文件1可能使用丙酮进行溶剂提取,但其后又进行了复杂的除杂步骤,最终获得的物质是经过纯化的黄酮类物质。而本申请仅用了丙酮等溶剂进行提取,获得了黄芪丙酮等提取物。从整体工艺来看二者差别巨大,选用丙酮作为溶剂是基于黄芪不同极性提取物对饲料的抗氧化效果的筛选实验,而不是根据对比文件1的方法。本申请的前提和目的是为了克服目前黄芪提取物在生产中普遍存在弊端,使其更利于在饲料中使用,而经过本实验室的创造性地劳动、努力研发获得的方法。其次,审查意见里指出:当选择饲用时,基于成本的考虑,可舍去上述复杂的纯化过程,但是,现有技术中并没有省去“过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换、再解析、洗脱”这些步骤还能够保证黄芪提取物的提取效率和药用效果的事实根据。若审查员坚持认为现有技术能够省去这些步骤,还能够到达本申请的技术效果,敬请审查员举证。
审查意见里指出:本领域已知黄芪能显著提高细胞免疫功能,有抗氧化作用;黄芪中富含多种有效成分,例如蒙古黄芪中经分析鉴定有176种化合物,即糖、有机酸、多酚类、黄酮、萜类等(参见“山西省“两区”开发农业产业化科技 指南“,张吉科,等,山西经济出版社,第223页,2008. 12),可见,黄芪中含有抗氧化的多酚;黄芪属豆科植物,豆科植物中的异黄酮还有雌性激素,抗氧化和溶血以及抗胆固醇和血脂,抑菌,抑酶等活性(参见对比文件1),即对比文件1已经公开了黄芪异黄酮具有抗氧化作用,关于黄芪中的异黄酮能抗氧化也有多篇现有技术记载,在此不作赘述。由于丙酮的极性能广泛的提取得到黄酮类、多酚类等,即黄芪及其提取物中含有抗氧化成分如异黄酮、多酚等是根据对比文件1和现有书籍的教导不难获知的,因此,不需要额外的数据证实,在用丙酮提取黄芪后,提取物具有抗氧化作用是不难预期的。申请人提供的两篇文献中指明黄酮类具有促氧化作用,但是并没有指明是黄芪的黄酮类是促氧化的,并不能直接说明和本申请的抗氧化是相反的启示。
申请人并不这样认为,在所含物质方面,申请人认为:第一,无论对比文件还是审查意见里的参考文献都没有阐述黄芪提取物直接具有抗饲料氧化的作用。黄芪提取物具有抗氧化作用是根据其可能所含的物质具有的可能抗氧化作用的推测。黄芪属豆科植物,豆科植物含有异黄酮(也属于黄酮类物质),有报道显示异黄酮具有抗氧化作用;同时,黄芪含有多酚类和黄酮类物质,有报道显示多酚类和黄酮类物质具有抗氧化性质。因此推测,黄芪提取物具有抗氧化作用(并非抗饲料氧化)。然而,这种推测是不可靠的,据报道这些物质具有促氧化性。几乎所有的植物体都含有黄酮类和多酚类物质,而且正如对比文件1所表示的这些物质‘种类很多(自然界已鉴定出的黄酮类化合物达8 000多个),在不同植物中含量不等、结构不同、生物活性也不相同’。更为重要的是已有的报道显示,这些物质具有促氧化性,而且黄芪所含的异黄酮、多酚类和黄酮类物质也具有促氧化作用。黄芪黄酮中包括黄芩苷、槲皮素、山萘酚、异槲皮苷等物质, 其母核均为 5-羟基黄酮;以及一些其他类型的黄酮, 如二氢黄酮、二氢异黄酮和查尔酮等[参考文献:苏优拉,陈贵林. 黄芪中黄酮类成分的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报,2021年,第12卷第3期]。黄芪还含有黄芪皂苷、大豆皂苷、异黄酮、异黄烷等物质[参考文献:《中药学》]。
第二,已有的报道显示,槲皮素作为黄酮类化合物的代表物质,能促进超氧阴离子和过氧化氢自由基的产生,导致活性酶SH-基团的氧化,能显著抑制胰腺β细胞的增殖,具有显著促氧化作用。山柰酚能导致细胞内产生的ROS 明显增加,具有显著的促氧化和细胞毒性。黄芩苷能导致氧自由基的产生和细胞凋亡,具有显著促氧化作用。在一般的情况下,促氧化作用较强的黄酮类化合物依次为:黄酮醇、黄酮、黄烷醇、黄烷酮。黄酮醇中促氧化作用较强的化合物主要有:槲皮素,杨梅酮、桑色素、山柰酚、3-羟基黄酮、非瑟酮、高良姜素;黄酮为:芹菜素、木犀草素、白杨素、芦丁、黄芩素、黄芩苷、金合欢素;黄烷醇为:二氢槲皮素;黄烷酮为:柚皮素,橙皮素、圣草酚,柚皮苷[参考文献:龚金炎,等. 黄酮类化合物的促氧化作用及其细胞毒性研究进展[J]. 中草药,2008年第39卷第12期;代永刚. 黄酮类化合物促进氧化作用的研究[J]. 中国食品添加剂,文章编号:1006-2513(2007)01-0070-03;SAHU S C,GRAY G C. Prooxidant activity of
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liver nuclei[J]. Cancer Letters,1996,104(2) : 196-196.]。
第三,异黄酮是天然存在于豆科植物中的黄酮类化合物。已有报道显示,异黄酮能通过促进脂氧合酶所介导的活性氧诱导骨骼肌细胞发生促氧化,并在一定条件下表现出促氧化特性[参考文献:陈伟,等.4-30异黄酮通过促进脂氧合酶所介导的活性氧诱导骨骼肌细胞发生促氧化[J].畜牧与兽医,2014年,第46卷197-198.]。陈伟等(2012)报道异黄酮在稍高浓度条件下表现促氧化作用,能导致细胞过氧化氢的含量明显增加、DNA损伤、细胞死亡率提高[参考文献:陈伟,等.一些抗氧化剂的抗/促氧化作用及其机制[J].动物营养学报,2012,24(4): 595-605;NORIYUKI
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enzyme and its inhibitory effect on enzyme activity[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,16 (19) : 8801-8805]。
第四,黄芪含有多酚类化合物。但已有报道显示,植物源多酚类化合物具有促氧化作用[参考文献:汪曙晖,等.天然抗氧化剂的抗氧化与促氧化作用[J].中国食物与营养,2016,22( 8): 68-71;郑丽芳.酚类抗氧化剂的结构修饰和促氧化机制研究[D]. 兰州:兰州大学]。作为多酚类物质的基本构件儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯在一定条件下能提高活性氧自由基的产生,起促氧化作用[参考文献:Tian J, Geiss C, Zarse K,
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第五,作为黄芪黄酮成分的大豆皂苷也被证实具有促氧化作用[参考文献:CHOIA E J,CHEEA K M,LEEB
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glutathione metabolism[J]. European Journal of Pharmacology,2006,542(3): 162-169.]
根据对比文件表述黄芪所含的异黄酮、多酚类和黄酮类物质可能具有的抗氧化作用,可推测黄芪提取物具有抗氧化作用(并非抗饲料氧化)。然而根据申请人提供的以上文献报道,指明了黄芪的异黄酮、多酚类和黄酮类具有促氧化作用,据此推测黄芪提取物应具有促氧化作用,即和本申请抗氧化相反的技术启示。一般认为普通物质的基本功能属性为‘有正效应、无效应、有反效应’。在众多的多酚或黄酮类物质中,无效的物质一定是存在的。当前已有的报道证实黄芪提取物具有‘正效应、无效应、反效应’的基本功能属性,因此已有的报道并不能给科研人员提供选择的倾向和技术启示。
在抗氧化方面,第一,关于植物所含的黄酮类或多酚类物质的报道多为其对氧自由基的清除作用上而产生的抗氧化作用,并没有其抗饲料氧化的报道;自由基和饲料是2种不同的物质。饲料中含有蛋白、脂类、糖类、维生素和矿物质等。饲料的多种原料经过必要的混合、调制和加工之后,其形态和性质与起初的原料相比发生了显著的变化,产生了本质的区别,使其成为了一种复杂的混合物而非纯合物。饲料中的许多物质可能被氧化,但也有可能抗氧化,氧化物质和抗氧化物质之间会发生复杂的相互作用,但最终表现出来的结果并不能由其中某个成分来判断;饲料中的不同物质的氧化机制不同,混合后的氧化机制也会发生复杂的变化,其结果需要参考多种因素的作用。最为可信和可靠的依据应该是饲料本身做为对象所表现出来的实际结果,而不是依据对自由基作用的推测。抗氧化物质对自由基的作用,只能说明其对自由基本身的作用,而不能说明其对饲料氧化的作用。对比文件中并无黄芪、黄芪提取物、黄芪的黄酮类和多酚类等物质抗饲料氧化的实验数据,也无相关文献引用和报道。对比文件也未阐述其他植物异黄酮、黄酮类或多酚类对饲料氧化的作用,即没有证据表明其可以抗饲料氧化。本申请公开了黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用。无论与化学合成抗氧化剂或天然抗氧化剂相比,黄芪丙酮提取物在饲料抗氧化效果、生产工艺和成本上都存在优势;而且具有提高鱼摄食和促生长的效果。以上对于对比文件而言具有预料不到的技术效果。
第二,世间的几乎所有物质在不同的条件下都能表现为‘氧化性’和‘抗氧化性’2种状态;几乎所有的生物机能都能归结为‘氧化还原(抗氧化)反应’。依此推断所有物质都可能具有抗氧化性。但事实上并不是所有物质都能起到真正的抗氧化作用,只有很少的物质能作为抗氧化剂被人类利用。同样的道理,植物材料中普遍存在多酚或黄酮类等物质,其可能对自由基有一定的清除作用,但其中实际具有抗食品或饲料氧化的的植物材料则极其有限,往往需从大量的植物材料中才能筛选出为数不多的有实际价值的植物材料。我们前期对20多种植物提取物进行饲料抗氧化筛选,仅得到4-5种有效的植物提取物,就是一个鲜明的证据。而且,已有的报道显示,多酚类或黄酮类等物质具有促氧化作用。因此,本领域技术人员不经过创造性地劳动是无法获得现实的结果的。
第三,本申请公开了黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用,而且提高了鱼的摄食量和增重率,并确定了黄芪丙酮提取物在饲料中的最佳添加量。黄芪提取物具有抗饲料氧化的作用,因此在饲料中不用添加合成抗氧化剂。目前在饲料工业中使用较多的抗氧化剂主要是合成抗氧化剂,包括乙氧基喹啉 (EQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等。但已有报道显示,这些抗氧化剂对动物具有致癌和遗传毒性,而且会导致其在鱼肉制品内的残留和富集,造成食品安全隐患危及人体健康。本申请克服了饲料添加合成抗氧化剂行业普遍存在的弊端,是本申请的突出特点与显著进步。
审查意见里指出:本申请的背景技术部分多处记载了,鱼饲料中的油脂含量高,极易氧化等,附图中也表明了黄芪提取物的抗亚麻酸氧化、抗亚油酸氧化等效果,可见,本申请的目的也是为了防止饲料中的油脂氧化。对比文件3公开了经抗氧化筛选试验,发现金钱草提取物对防止食用油脂、含油脂食品和含油脂饲料的酸败有很好的效果(参见对比文件3的第5页的第1-2段),可见,对于含油脂饲料具有抗氧化作用并不是推测,虽然对比文件3是金钱草,但是其给出了将具有抗氧化功能的中药提取物添加到含油脂的饲料中,以防止其氧化、酸败的技术启示。因此,在上述对比文件2-3的启示下,所属技术领域的技术人员有动机对对比文件1的技术方案进行改进,将具有抗氧化功能的黄芪提取物用于制备鱼饲料,以扩大黄芪的应用范围,并防止饲料的品质劣化。
对于以上质疑,申请人认为:第一,对比文件3公开了金钱草提取物作为天然抗氧化剂的方法,并表述此方法可用于含油脂的饲料。首先金钱草属于中草药,但有记载的中草药植物有上千种,金钱草不能代表所有中草药;金钱草提取物具有抗氧化作用,但并不能据此说明所有中草药提取物都具有抗氧化作用。黄芪属于中草药,但与金钱草存在巨大的差异。金钱草为报春花科珍珠菜属植物,主要利用地上部分;而黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪属,主要利用其根部。
第二,从对比文件3的文中表述可见,金钱草主要用于食用油脂的抗氧化,将其用于饲料是一种推测。文中表述此方法可用于含油脂的饲料,但并无金钱草提取物作为饲料抗氧化剂的实验数据,也无相关实施例和文献引用。其阐述的并非金钱草提取物对饲料本身氧化的作用,而是其对食用油脂的作用。即金钱草提取物能抗食用油脂的氧化,但并没有证据表明其可以抗饲料氧化,更不能说明黄芪提取物有相同的作用。
第三,由于合成抗氧化剂乙氧基喹啉、BHT和BHA对食品存在安全隐患[https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_18159.htm],2017年2月,欧盟公布:停止在动物饲料中添加使用乙氧基奎琳(2017年第G/SPS/EU/190公告)[http://news.feedtrade.com.cn/ 2017-04-11 12:58:36]。部分国家规定禁止食用添加合成抗氧化剂饲料喂养的动物内脏;美国规定乙氧基奎琳在宠物饲料中的浓度不能超过75PPM[参考文献:Błaszczyk A, Augustyniak A, Skolimowski J. Ethoxyquin: an
antioxidant used in animal feed (乙氧基奎琳:一种动物饲料抗氧化剂)[J]. Int J Food Sci (国际食品科学杂志), 2013, 2013:1-12.]。因此这些合成抗氧化剂的弊端将导致市场对天然来源的抗氧化剂的需求提高;从人体健康和市场需求考虑,开发新型天然的饲料抗氧化剂具有重要意义。
第四,当前我国已规定,自2020年1月1日起,退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,不许生产,原批号作废[中华人民共和国农业农村部194号公告],并对天然植物为原料的提取物申报新饲料添加剂,适当放宽其分析检测和评价材料要求[中华人民共和国农业农村部226号公告和227号公告],并加快制定《饲料原料目录》中天然植物为原料的新饲料添加剂注册简化规则[中华人民共和国农业农村部
农办议[2020]435号],鼓励天然植物提取物饲料添加剂的开发。黄芪属于饲料原料,属我国大宗中草药之一,资源丰富,但每年大量的黄芪采收和加工副产物利用十分有限。利用提取工艺获得黄芪有效成分,开发其饲料利用价值,增加其新用途,改善其传统的利用结构,发挥其综合利用潜力,提高其经济和社会效益,具有十分重要的意义。
第五,如果仅以金钱草提取物的专利报道,作为所有中草药申请的对比文件,将大大阻碍中草药来源的新型天然饲料抗氧化剂的开发,有违国家政策鼓励天然饲料添加剂开发的思想。
且上述区别技术特征也不是本领域的公知常识,因此,修改后的权利要求1相对于对比文件1-3以及公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。
三、关于修改后权利要求2的创造性
修改后权利要求2与修改后的权利要求1具有单一性,在修改后的权利要求1具有创造性的前提下,修改后权利要求2也必然具有创造性。
综上所述,本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步,因而具有创造性。如有问题,望及时联系申请人或代理人,给予再次答复的机会,联系电话:13551134124。
请审查员继续审查。
申请人:内江师范学院
2022年06月30日