尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年04月11日发出的关于《一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求1和5合并成新权利要求1,并将权利要求2的技术特征补入新权利要求1;
将原权利要求6~7依次改成新权利要求5~6。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
具体的修改内容详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)修改后的权利要求1具有创造性
权利要求1请求保护一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株。对比文件1公开的是FaSSIF(喂食状态模拟肠液)对低水溶性化合物溶解度和溶解/渗透速率的影响。
权利要求1相较于对比文件1具有以下区别特征:1)人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO,于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC
NO.C202024。2)细胞株的构建方法为:通过CRISPR/Cas9技术构建,将核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示的单链DNA进行退火反应,得到双链DNA短片段,连接入CRISPR/Cas9载体,所述CRISPR/Cas9载体以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA作为识别序列,获得重组敲除载体,将重组敲除载体电转染到人结直肠腺癌细胞系中,经抗性和测序筛选获得人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO。对比文件1研究了ABT-102在FaSSIF中的表观溶解度,以Caco-2细胞进行细胞培养获得的Caco-2模型作为屏障。
针对上述区别技术特征,本申请实际要解决的技术问题为:构建结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株。
为解决上述技术问题,本申请通过CRISPR/Cas9技术,利用gRNA作为识别序列,将SEQ ID NO:2~3所示的单链DNA退火后连接入CRISPR/Cas9载体,精确且高效的敲除了TRPV1基因,有效的构建了一种TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系。
对比文件2研究的是瞬时受体电位通道(TRPV1)在热性惊厥中的作用及其机制,采用的方法为:高热诱导C57BL/6野生型小鼠和TRPVI基因敲除鼠热性惊厥后:比较两组间热性惊厥行为学、脑电图及核心温度的差异;ELISA检测两组间大脑及经辣椒素和高热处理后BV2 细胞中炎性因子的表达差异。显然,对比文件2并未公开“通过CRISPR/Cas9技术,利用gRNA作为识别序列,将SEQ ID NO:2~3所示的单链DNA退火后连接入CRISPR/Cas9载体,敲除了TRPV1基因,构建人结直肠腺癌细胞系”的技术构思。而且,通过对比文件2公开的内容,不难推测出对比文件2使用了辣椒素受体拮抗剂,并且其获得的研究结论为:激活TRPV1 可刺激炎性因子分泌,促进反复热性惊厥的发生,提示TRPV1通道可能是热性惊厥发生的潜在易感基因。
进一步地,审查意见中认为:对比文件1公开了利用抑制剂获得TRPV1抑制的Caco-2细胞模型,本领域知晓抑制特定基因表达是基因工程常规的技术手段,常见的可供选择的操作有:小RNA抑制、抑制剂、基因敲除、基因突变等。本领域技术人员出于丰富抑制手段的考虑,也有动机从现有技术中获得常规的抑制基因的表达手段作用于对比文件1所述Caco-2细胞。在此基础上,对比文件2公开了利用基因敲除手段获得的动物,由此可知基因敲除的手段可以用于敲除TRPV1。因此,本领域技术人员不难想到利用基因敲除的手段对Caco2细胞的TRPV1基因敲除。而对其命名和保藏则是常规操作,不会改变细胞的组成和/或结构。
对此,申请人仔细阅读本次通知书的内容,认为本发明取得了意料不到的技术效果,满足创造性的规定,具体理由如下。
本发明在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中,设计一对扩增片段长度为272 bp的检测引物,并设计了3个靶位点以及特定靶序列引物,精确且高效的敲除了TRPV1基因特定的功能区域。对比文件1中的目的是研究FaSSIF对悬浮液中难溶化合物TRPV1拮抗剂ABT-102在Caco-2细胞单层的表观溶解度和溶解/渗透速率的影响,以Caco-2细胞单层为模型进行实验,对比文件1未公开如何设置打靶目标、也没有公开采用本发明设计的特异性靶序列引物敲除TRPV1基因特定的功能区域,因此,对比文件1并未公开本发明的设计原则,对本发明不具备技术启示。
最高人民法院明确指出,“面对实际要解决的技术问题,本领域普通技术人员从现有技术中可以获知的技术启示,原则上应该是具体、明确的技术手段,而不是抽象的想法或者一般的研究方向。仅仅依据研究方向的一致性和本领域的抽象、普遍需求来认定现有技术给出的启示,隐含着后见之明的危险,容易低估发明的创造性”(参见“最高人民法院知识产权法庭裁判要旨(2019)摘要”)。
同时,虽然都是常规的技术手段,但是基因敲除相对于抑制剂和小RNA抑制具有更好的抑制效果,因为不管是抑制剂还是小RNA抑制都存在抑制试剂脱靶毒性(试剂抑制效果减弱或者失效)和基因补偿(机体通过加大基因表达进行补偿)的问题,而基因敲除可以完全规避这两种情况。本研究在进行相关实验时曾经尝试过抑制剂和小RNA抑制的方式,但是未取得较好抑制TRPV1基因表达的效果。所以才尝试进行基因敲除的方法。
因此,对比文件1实质上就是仅仅提供了一种抽象的研究方向,并未给出具体、明确的技术启示,不能否定本发明权利要求1的创造性。
同样地,对比文件2中也仅提到TRPV1基因敲除小鼠,并没有提及如何设置打靶目标,也没有提及使用什么方法进行敲除,更没有提到具体敲除TRPV1基因的哪一个区域才能获得成功的敲基因小鼠,因此,对比文件2对本发明也不具有技术启示。
本发明在进行基因敲除细胞构建时,选择了很多的敲除区域,存在没有敲除效果、脱靶率高、或敲除后细胞都未能存活的问题,在历经大量失败实验后,在对TRPV1基因进行全面分析,包括序列、二级机构以及空间结构等分析,最终在使用本发明选定的特定区域内进行靶序列引物、靶点敲除的设计,最终才获得了存活的敲基因细胞,解决了使用辣椒素受体拮抗剂的缺陷(脱靶毒性和基因补偿),因此,本发明细胞株是付出了大量的创造性劳动才获得的成果。
综上,申请人认为,本发明权利要求1中请求保护的人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株,对比文件1、2均没有给出相关的技术启示,本发明相对于对比文件1、2具备非显而易见性,具有突出的实质性特点和显著的进步,具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。
2)修改后的权利要求2~6具有创造性
修改后的权利要求2保护的是一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列。结合权利要求1的阐述,本领域技术人员通过对比文件1、对比文件2结合常规技术手段无法显而易见地获得权利要求1的技术内容,那么在此基础上,本领域技术人员也无法通过常规手段获得用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列,即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。权利要求2也具备创造性。
权利要求3保护的是一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对,其具有创造性的理由同权利要求2。
权利要求4保护的是权利要求2所述的sgRNA的识别序列和/或权利要求3所述gRNA引物对在敲除TRPV1基因中的应用。是基于权利要求2和/或权利要求3的技术方案而实现,在权利要求2或3具有创造性的前提下,权利要求4也具有创造性。
权利要求5保护一种含有SEQ ID NO:2~3所示的gRNA引物对的质粒载体,其具有创造性的理由同权利要求2。
权利要求6保护的是权利要求5所述的质粒载体在构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株中的应用。是基于权利要求5的技术方案而实现,在权利要求5具有创造性的前提下,权利要求6也具有创造性。
申请人认为,以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷,希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处,恳请再给予修改/陈述意见的机会。
最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。