尊敬的审查员：

感谢您对发明申请“专利名称：一种基于黄芪提取物的鱼饲料及其制备方法、申请号：2018113950848” 的辛勤审查，针对其第二次审查意见，申请人经过充分考量，再次对第二次审查意见答复（含6月30日提交的补充意见陈述）做出补充的意见陈述，敬请审查员在对本申请审查的时候，一并考虑补充意见，感谢您的付出！申请人补充意见陈述如下：

1、在提取物成分和提取方法上的创新

（1）针对审查意见里的质疑，我们认为对比文件1公开了一种从黄芪中提取黄芪总黄酮和总苷的方法。其提取过程包括除可以使用包括丙酮在内的有机溶剂之外，和进一步分离纯化的步骤。其目的是获得纯度较高的黄酮和皂苷类物质，尤其是黄酮类。而本申请的目的是获得一种具有抗饲料氧化的黄芪提取物。由此可见，对比文件1具有参考价值的前提是其所获得的黄酮类具有抗氧化作用。审查意见里提出：黄芪因含有黄酮类（对比文件1：异黄酮）和多酚类物质而具有抗氧化性；而我们查阅资料后发现：黄芪的黄酮类和多酚类物质具有促氧化性，即与本申请相反的技术启示（见2022-06-30第一次二审主动补正）。在不确定其黄酮类物质是否是其抗（饲料）氧化作用的活性成分的情况下，本申请是不需要考虑黄芪提取物中是否含有黄酮以及其纯度几何。因此，就不需要参考“一种从黄芪中提取黄芪总黄酮和总苷的方法”，即对比文件1。

（2）审查意见里提出：对比文件1在提取黄芪过程中，“经过了过滤冷却、加水萃取、吸附分离、解析、离子交换等复杂的过程，其目的主要是纯化，如果基于简化操作、使用目的考虑，可常规选择是否进行后续的纯化。况且，在本领域，中药人用、饲用均是常规的，因此，当选择饲用时，基于成本的考虑，可舍去上述复杂的纯化过程”。我们并不这样认为，基于廉价易得考虑，简单的提取方法固然更为有利；但本申请的目的是获得一种具有抗饲料氧化的黄芪提取物，是否具有抗饲料氧化作用和达到“预料不到”的良好效果，是我们应该着重考虑的。因此出于以上目的，是否采用有机溶剂提取，以及是否进行复杂的纯化步骤，是无法预期的。进一步讲，发明人与科研人员不经过创造性劳动是无法得出本申请使用丙酮提取的最佳方法的。目前，关于黄芪提取物对饲料的抗氧化作用，未见报道。因此，针对对比文件而言，黄芪提取物的抗饲料氧化作用及其优良的效果是预料不到的。退一万步来说，即使对比文件1的方法有稍许参考价值，但现有技术中并没有省去对比文件1“纯化”步骤还能够保证黄芪提取物的提取效率和作用的事实根据。若审查员坚持认为现有技术能够省去这些步骤，还能够达到本申请的技术效果，敬请审查员举证。

2、关于对比文件2的技术启示

（1）审查意见里提出“对比文件2 (CN108094766A)公开了一种黄芪和复合益生菌配伍的饲料添加剂及其应用，该饲料添加剂由黄芪微波蒸馏粗提物、黄芪乙醚粗提物、双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂制成。可见，对比文件2给出了将黄芪提取物用于鱼饲料的启示”。我们并不认同以上观点，首先本申请在饲料中仅添加了黄芪提取物中的一种，主要是丙酮提取物，其主要成分是黄芪含有的极性较大的物质；而对比文件2中无论黄芪微波蒸馏粗提物还是黄芪乙醚粗提物其成分均是黄芪含有的极性较小的物质，此外还含有双歧杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌制剂。因此，在物质成分上本申请与对比文件2存在显著的不同。对于本申请来说，其目的是“获得一种具有抗饲料氧化的提取物”，而对比文件2并没有说明其“添加剂”具有上述功能。虽然对比文件2中添加剂的“提高鱼的抗病力，加快鱼的生长”可以作为是否其能用于饲料的次要参考条件，然而其“添加剂”是一种包含5种成分的复合物，只能说明添加剂的组合功能，并不能说明黄芪提取物（其单一组分）具有同样的功能，即并不能说明‘黄芪提取物’具有“提高鱼的抗病力，加快鱼的生长”的作用。而且已有的报道显示：黄芪提取物具有不适用于鱼饲料的负面作用，具体如下所示。

（2）根据审查意见所述，黄芪含有多酚类和黄酮类等活性物质。常见的黄芪的黄酮类物质包括槲皮素、山奈酚、黄芩苷、大豆皂苷等。已有的报道显示，这些物质能促进活性氧自由基的产生，导致细胞活性酶SH-基团和生物大分子的氧化，抑制细胞的增殖和导致细胞凋亡，产生细胞毒性和显著的机体氧化应激。而且，有报道显示，包括槲皮素在内的大部分黄酮醇在Ames试验及其他体外试验中都表现出了遗传毒性和致癌性。黄酮类化合物能够通过多种途径与体内细胞色素P450、葡糖苷酸转移酶、代谢外源物的单氧酶等相互作用，通过诱导DNA的表达调控(抑制或活化)酶的活性，参与其代谢活动，导致一些致癌物质的活化、有毒代谢产物的产生、药物的过度积累等有害影响；能抑制动物甲状腺过氧化物酶(TPO)活性，并干扰甲状腺激素的生物合成，从而产生甲状腺毒性；能与蛋白质结合并抑制多种酶的活性，还能与金属离子形成稳定的复合物，降低蛋白质和矿物质的生物利用率，具有抗营养作用。另据报道，这些黄酮类物质可能对动物具有神经毒性。黄芪属于豆科植物，含有异黄酮。有报道显示，异黄酮能通过促进脂氧合酶所介导的活性氧产生而诱导细胞发生促氧化。陈伟等（2012）报道异黄酮在能导致动物机体细胞活性氧自由基（过氧化氢）的含量明显增加、DNA损伤、细胞死亡率提高。而且据报道，异黄酮是一类具有类雌激素活性的化合物，不当摄食异黄酮可能会导致体内激素代谢和内分泌功能的紊乱，从而产生不良后果。另据报道，异黄酮可能对动物具有致癌作用、生殖内分泌毒性、免疫毒性等。

据报道，黄芪所含的黄酮类物质能导致动物采食量和消化吸收功能降低以及生长缓慢。陈伟（2009）研究发现，饲料中添加0.8%的异黄酮显著降低了牙鲆的平均体重和表观消化率，并导致牙鲆后肠组织的病理性变化。郭海燕等（2014）报道，在日粮中添加20和100 mg/kg木黄酮（异黄酮中的一种主要活性因子）使大菱鲆幼鱼粗脂肪含量显著下降。Mai等（2012）报道，饲料添加8 g/kg异黄酮会使牙鲆的末重、饲料效率及粗脂肪含量明显下降。张伟等（2010）研究表明，饲料中添加0.72%异黄酮能使异育银鲫特定生长率及蛋白质效率显著降低，其饲料系数显著上升。鱼类的生长与其消化道消化酶活性存在密切关系。王军等（2013）研究表明，注射2 μg/g与20 μg/g金雀异黄素（一种存在于黄芪等豆科植物中的天然异黄酮化合物）到金鱼腹腔，金鱼的肠道消化酶活性会明显下降。Chen等（2014）研究发现，日粮中加入300μg/g与3000μg/g木黄酮会有效降低尼罗罗非鱼胃蛋白酶与肠道淀粉酶活性。郭海燕等（2014）发现，饲料中加入5-100 mg/kg木黄酮，会使大菱鲆幼鱼胃蛋白酶和肠道淀粉酶水平下降；当剂量为100mg/kg时，大菱鲆幼鱼肠道结构被破坏。陈密等（2019）发现，在饲料中添加388.4 mg/kg芦丁（一种广泛存在于植物中的天然黄酮苷）会下调草鱼肠道胰蛋白酶活力。

黄芪含有多酚类化合物，已有报道显示，植物源食物中的多酚类化合物对动物具有促氧化和诱导氧化应激的作用。作为酚类物质的基本构件儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯在一定条件下能提高活性氧自由基的产生，导致动物机体氧化应激。而且，梁高杨等（2018）报道，添加茶多酚（600、800mg/kg）显著降低了奥尼罗非鱼表观消化率，肠道淀粉酶、蛋白酶活性和全鱼粗脂肪含量。单宁是一类广泛存在于植物中、在豆科植物含量较多的多酚类物质，主要有缩合单宁和可水解单宁2种。单宁分子中大量的酚羟基团和芳香环结构，可与鱼用配合饲料及鱼体消化酶中的蛋白质生成络合物，使蛋白质凝结沉淀，降低蛋白质效率和净蛋白质利用率，并影响鱼类的摄食量和其它营养素的消化吸收。单宁亦阻碍胰蛋白酶及α-淀粉酶与底物形成可溶性复合物或降低这些酶的活性。单宁也与VB12形成复合体从而降低动物对VB12的吸收率。在饲料中添加质量分数为2%的可水解单宁，导致了鲤停止摄食。可水解单宁易降解形成小分子化合物进入血液，引起肝、肾等器官中毒。

黄芪在人医临床应用中可引起多种不良反应，以过敏反应最为常见，包括皮肤过敏、高热、哮喘、过敏性休克等。朱江波等（2007）认为黄芪甲苷在1.0 mg/kg剂量时对SD大鼠有母体毒性；1.0 mg/kg以上剂量对新西兰兔和SD大鼠均有一定的胚胎毒性。张硕等（2020）报道，黄芪、莪术配伍抑制了斑马鱼血管的生成。殷学军等（1989）通过试验证实黄芪水溶性提取物具有诱变性。倪文澎等（2004）的试验结果表明，单味黄芪在小鼠骨髓微核试验中呈阳性。通常认为中药中具有诱变活性的成分可能是生物碱、蒽醌衍生物或黄酮类化合物。

根据申请人提供的以上文献报道，指明了黄芪所含的黄酮类和多酚类物质，即所谓“抗氧化”成分能促进活性氧的产生、生物大分子的氧化，导致动物摄食、消化吸收功能和生长速度降低等负面结果。据此推测所谓的“抗氧化剂”具有促氧化、诱导应激甚至毒性的作用，即“不适用于鱼饲料”及和本申请相反的技术启示。相对于对比文件1和2，本申请黄芪（丙酮）提取物的研究结果产生了优良的抗饲料氧化、提高鲤鱼摄食量（51.7%）和增重（44.5%）等预料不到的技术效果。

3、关于对比文件3的技术启示

    审查意见里提出“本申请的背景技术部分多处记载了，鱼饲料中的油脂含量高，极易氧化等，附图中也表明了黄芪提取物的抗亚麻酸氧化、抗亚油酸氧化等效果，可见，本申请的目的也是为了防止饲料中的油脂氧化。对比文件3公开了经抗氧化筛选实验，发现金钱草提取物对防止食用油脂、含油脂食品和含油脂饲料的酸败有很好的效果，可见，对于含油脂饲料具有抗氧化作用并不是推测，虽然对比文件3是金钱草，但是其给出了将具有抗氧化功能的中药提取物添加到含油脂的饲料中，以防止其氧化、酸败的技术启示。因此，在上述对比文件2-3的启示下，所属技术领域的技术人员有动机对对比文件1的技术方案进行改进，将具有抗氧化功能的黄芪提取物用于制备鱼饲料，以扩大黄芪的应用范围，并防止饲料的品质劣化。”

对于以上的陈述，申请人存在许多疑问：第一，对比文件3确实公开了金钱草提取物具有抗脂质氧化的作用。但黄芪并不等同于金钱草，黄芪与金钱草之间存在巨大的差异。金钱草为报春花科珍珠菜属植物，主要利用地上部分；而黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪属，主要利用其根部。第二，金钱草属于中草药，但有记载的中草药植物有上千种，金钱草不能代表所有中草药；金钱草提取物具有抗脂质氧化的作用，但并不能据此说明黄芪或所有中草药提取物都具有抗脂质氧化的作用。第三，对比文件和已有的文献资料均未见：黄芪提取物具有抗脂质氧化作用的报道；而且有黄芪活性成分“促氧化”的相关报道，因此其不具备抗饲料氧化的前提条件。第四，对比文件3表述了使用金钱草提取物抗食用油脂以及含油脂饲料氧化的方法，但目前并无金钱草提取物作为饲料抗氧化剂的实施例、实验数据和文献报道，其应用极有可能是发明人根据其抗脂质氧化作用的推测。虽然具有抗油脂氧化作用的物质更有可能具有抗含油脂饲料氧化的作用，但具体何种物质（包括中草药）具有抗油脂质氧化的功能，需要研发人员付出创造性的劳动；至于其具体的抗氧化效果，则需要将其直接用于饲料本身进行实验，以数据事实加以确定才具有说服力。目前并没有“将具有抗氧化功能的中药提取物（包括黄芪提取物）添加到鱼饲料中，以防止其氧化酸败”的实际应用、数据支撑和实验报道。本申请将黄芪提取物用于饲料抗氧化剂，是目前在中草药提取物中首次有实验数据作为支撑的公开报道。若审查员不认同我们的观点，敬请举证。

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