尊敬的审查员:

本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年7月05日发出的关于《一种微环DNA及其制备方法与应用》的第二次审查意见通知书,对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。

一、修改说明

将原权利要求1~3、5合并成新权利要求1;

将剩余权利要求做相应的适应性修改。

以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

具体的修改内容详见权利要求书替换页。

 

二、意见陈述

1)权利要求1具有创造性

本申请权利要求1请求保护一种微环DNA的制备方法,对比文件1公开的是位点特异整合型微环DNA的构建及应用。本申请相较于对比文件1至少具有以下区别特征:

(1)以MN511A-1质粒为基础质粒,设计引物,进行PCR扩增,在CMV-EGFP-polyA阅读框两侧分别引入lox66及lox71位点,得到扩增产物一,其中所述引物序列分别如SEQ ID NO:1~4所示;

其中,引入lox66位点的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,引入lox71位点的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示,

(2)用SacII和StuI同时双酶切所述扩增产物一,连接后,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,得到pYL19完整质粒;

(3)将pYL19完整质粒进行PCR扩增,并引入XmaI和PacI酶切位点,得到扩增产物二;其中进行PCR扩增的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;

(4)将PGK-cre-polyA质粒进行PCR扩增,并引入XmaI和PacI酶切位点,得到扩增产物三,所述扩增产物三为含有PGK启动子、Cre重组酶及PolyA尾的阅读框;其中进行PCR扩增的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;

(5)用XmaI和PacI同时双酶切所述扩增产物二和所述扩增产物三,连接后,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,得到pYL46完整质粒;

(6)对所述pYL46完整质粒提取重组质粒,然后将提取的重组质粒瞬时转染至培养状态良好的人胚肾 HEK-293 T细胞,检测Cre重组酶表达及微环DNA形成;所形成的微环DNA含有编码EGFP绿色荧光蛋白报告基因;

所述检测Cre重组酶表达的方法具体为: pYL46重组质粒转染HEK-293 T细胞24h后,收集细胞蛋白进行Western-Blot检测,并对该细胞进行免疫荧光,检测Cre重组酶表达;

所述检测微环DNA形成的具体方法为:pYL46重组质粒转染HEK-293 T细胞24h后,使用细胞核提取试剂盒提取细胞核,再以酚氯仿法提取细胞核中总DNA,使用PCR的方法检测mcDNA的形成,所采用的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

基于上述区别技术特征,本申请实际要解决的技术问题为构建一种较比质粒DNA能更有效进入宿主细胞核进而提高目的基因转录水平及目的蛋白表达量的mcDNA

为了解决上述技术问题,本申请的技术路线为:MN511A-1质粒为基础质粒,通过PCR扩增技术在CMV-EGFP-polyA阅读框两侧分别引入lox66lox71位点得到扩增产物一;然后SacIIStuI同时双酶切扩增产物一,连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞得到pYL19完整质粒;再将pYL19完整质粒进行PCR扩增,并引入XmaIPacI酶切位点,得到扩增产物二;再PGK-cre-polyA质粒进行PCR扩增,并引入XmaIPacI酶切位点得到扩增产物三XmaIPacI同时双酶切扩增产物二和扩增产物三,连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞,得到pYL46完整质粒;pYL46完整质粒提取重组质粒,然后将提取的重组质粒瞬时转染至培养状态良好的人胚肾 HEK-293 T细胞

 

二审通知进一步指出:1)本领域技术人员可根据实际使用需求,常规选择是否使用φC31介导的attB 位点将微环DNA整合到基因组的特定位点中,以及常规选择Cre/loxp介导的重组系统,并且能够想到在CMV、SV40 poly-A表达元件两端分别引入切割位点。2)对比文件2公开了一-种将重组酶基因连接到亲本质粒中,经表达后直接对亲本质粒进行切割、重组,高效、快捷地获得微环DNA的方法。因此,在对比文件2的启示下,本领域技术人员有动机将Cre重组酶连接到亲本质粒上,并想到使用真核细胞启动子、以及连接polyA、采用HEK-293T细胞等操作。因此,在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领城惯用手段,得到权利要求1请求保护的技术方案,对本领域技术人员来说是显而易见的。

对此,申请人完全无法赞同,理由如下:

其一,对比文件1的技术方案为:通过单链混合加热方式获得两端分别为Spe I和Dra III限制性酶切位点黏性末端的λattR双链。以限制性内切酶Pvu IISpe I分别酶切质粒pPGKPhiC31obpApcDNA3.l(-)-P1A3-TPO;然后pEGFP-N1-attB 质粒的Spe IDra III酶切位点之间插入λattR 片段,在Afl IIIAse I酶切位点之间插入λattL 片段,获得质粒后,在Afl III酶切位点处插入φC31 整合酶表达盒,获得亲本质粒pEGFP-PP,然后限制性内切酶BamH INot I双酶切,去除EGFP后载体自连,并在Nhe I酶切位点处插入hTPO,获得亲本质粒pTPO-PP,同样的方法获得pTPO-C;然后将两种亲本质粒进行重组;重组后转染Hela细胞一方面,mcDNA的制备主要依赖于同源重组位点及位点特异性重组酶如phiC31、Cre、ParA及BxbI,本申请背景技术中有介绍,因此,这些位点已经是本领域的公知常识,不通过这些位点不能获得mcDNA,这是一项重要基础但是现有技术或是对比文件1并未启示或者教导如何对表达框、质粒、位点、体内、体外、扩增引物的选择、设计以及进行相应处理进而获得具有较强免疫功能的微环DNA另一方面,本申请和对比文件1在具体微环DNA的制备方案上存在诸多区别,审查员基本都用“通过常规选择”来对这些区别技术特征加以否定,如果是常规,那么为何本申请公开的这种微环DNA在现有技术中并未出现呢?显然,这种观点属于审查员的个人臆断。

其二,对比文件2公开的一种将重组酶基因连接到亲本质粒中,经表达后直接对亲本质粒进行切割、重组,高效、快捷地获得微环DNA的方法,属于体内制备微环DNA的方法。而对比文件1为体外制备微环DNA,那么对比文件1和对比文件2又怎么能结合到一起去评价本申请的创造性呢?申请人在一通中已经指出这一点,到现在仍然无法理解。退一步而言,即便本领域技术人员将对比文件1和对比文件2进行结合,可以得到的技术启示为:将对比文件2获得目的片段、构建亲本质粒、以及将重组酶基因连接到亲本质粒、再切割、重组的方法用于对比文件1进行微环DNA的体外构建,或者将对比文件1获得目的片段、构建亲本质粒、以及将重组酶基因连接到亲本质粒、再转染、重组的方法用于对比文件2进行微环DNA的体内构建。

此外,在本申请和对比文件1、对比文件2的技术内容完全不一致的前提下,如果本案的这些区别技术特征都是常规选择的话,那么所获得的微环DNA的相关性能和应用效果也应该是很普通的。但本申请具体实施例1结合图6表明细胞核中可提取得到pYL46质粒转变得到的mcDNA,且这种mcDNA比质粒pYL19更容易进入细胞核。图7表明,12h,24h,48h不同时间点EGFP的相对表达量pYL46都是pYL46的2倍左右,说明能产生微环的pYL19表达量更高。图8表明pYL46组与pYL19组相比,蛋白表达量提高约2~3倍。实施例2将本申请制备的微环DNA用于抗鸡新城疫病毒,结合图12和图13表明该微环DNA可提供80%的保护率,并且雏鸡肺脏损伤较轻,有望开发成mcDNA疫苗用于鸡只的抗新城疫病毒保护。通过对比文件1和对比文件2关于其微环DNA功效上的描述,没有用作抗鸡新城疫病毒产品的介绍,显然,本申请的技术效果较比对比文件1、对比文件2更为显著

因此,本申请的技术方案较比对比文件1、对比文件2结合常规技术手段具有突出的实质性特点和显著进步。

2)权利要求2~3具有创造性

权利要求2保护的是权利要求1所述的制备方法获得的微环DNA,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求2也具备创造性。

权利要求3保护的是权利要求2所述微环DNA或权利要求1所述微环DNA的制备方法获得的微环DNA在制备抗鸡新城疫病毒细菌制剂中的应用方法。审查员进一步举出了对比文件3,并且认为对比文件3公开了将微环DNA质粒在制备DNA疫苗中的优势。对此,申请人仍然不能赞同,理由为:对比文件3只是阐述了微环DNA在疫苗中使用具有吸引力,其并未具体载明指向哪种特定微环DNA可以用于开发疫苗,具体开发成哪种疫苗更是没有任何启示或教导。而且对于微环DNA可能用于疫苗开发在本领域已经成为共识,但是科学就是科学,未经证实仍然是猜想。另外,对比文件3也未给出微环DNA可以开发成制备抗鸡新城疫病毒细菌制剂的切实证据。因此,对比文件3并不能对权利要求3构成显而易见地技术启示。

申请人认为,以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷,希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处,恳请再给予修改/陈述意见的机会。

最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。