尊敬的审查员:

本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年05月11日发出的关于《一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。

一、修改说明

将原权利要求1~6合并成新权利要求1。

以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

具体的修改内容详见权利要求书替换页。

二、意见陈述

权利要求1具有创造性

权利要求1请求保护一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法。对比文件1研究的是脂多糖暴露对原代牛瘤胃上皮细胞的影响。权利要求1与对比文件1相比至少以下区别技术特征:

(1)本申请限定的是瘤胃腹囊处瘤胃组织,并且在获得组织后采用温度为4-8℃的灭菌水清洗。对比文件1则先采用含有抗生素-抗真菌溶液、Ca2+和Mg2+的DPBS清洗,切除瘤胃乳头的基部并在不含Ca2+和Mg2+的DPBS溶液中彻底清洗。

(2)本申请将瘤胃上皮组织剥离后依次采用灭菌水、PBS溶液一和PBS溶液二清洗,清洗后剪碎并采用消化液多次消化;PBS溶液一pH值为7.4,含有终浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠; PBS溶液二含有体积浓度为2%的青霉素-链霉素-两性霉素B混合液(100×三抗),青霉素-链霉素-两性霉素B混合液(100×三抗)中青霉素含量10kU/ml,链霉素含量10 mg/ml,两性霉素B含量25 μg/ml;消化液按照终浓度的组成为:胰蛋白酶 2.5~5%(w/v),CaCl2 1.08 mM,HEPES25mM,ABAM 2%(v/v),溶剂为Krebs-Ringer缓冲液。对比文件1则是直接进行消化,采用的是胰蛋白酶,并且消化3-6次。

(3)本申请对瘤胃上皮细胞团采用MEM基础培养基培养,培养的控制参数为:于37℃、含5%CO2、95%湿度条件下培养4~5天,期间每隔1~3d更换一次完全培养基继续培养,待完成85%以上细胞铺层。对比文件1采用的培养基组成为:含有15%胎牛血清、1.36mM谷氨酰胺、20Mm HEPS、抗生素(终浓度为100U/ml青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/ml两性霉素B) -抗真菌溶液(240U/mL nystatin、50mg/L 庆大霉素和100mg/L卡那霉素)的M199培养基;培养过程则较为繁琐。

显然,本申请与对比文件1的技术方案差距较大。

针对上述区别技术特征,本申请实际要解决的技术问题为:如何获得纯度高、活力强、生长快的瘤胃上皮细胞

为了解决上述技术问题,本申请改进和优化了瘤胃上皮细胞分离培养技术,可以获得纯度高、活力强、生长快的瘤胃上皮细胞,还可以有效降低瘤胃上皮细胞体外培养污染的可能性,并能培养时间缩短为23d开始贴壁,45d完成铺层,普遍在4天左右完成。对比文件1获得瘤胃上皮细胞则需要15~17天

进一步地,审查意见中认为:1、瘤胃组织的选取、剥离、消化、洗涤溶剂的选择替换等都是常规操作。2、对比文件2公开了消化液的组成,本领域技术人员有动机以对比文件2的消化液为基础,进行改进代替对比文件1的消化液。3、对比文件1公开了采用MEM基础培养基培养的过程,本领域技术人员容易结合对比文件1公开的培养条件对分离获得的犊牛瘤胃上皮细胞进行培养,并确定相应的参数,本申请并未提供实验数据证明上述参数的调整相较于现有技术产生何种有益的技术效果。

对此,申请人完全难以认同,具体分析如下:

其一,上文的区别技术特征显示本申请与对比文件1差距较大,针对创造性的判断应当整体看待对比文件1的技术方案,对比文件1并未启示或者教导:1)将先采用含有抗生素-抗真菌溶液、Ca2+和Mg2+的DPBS清洗瘤胃组织,切除瘤胃乳头的基部并在不含Ca2+和Mg2+的DPBS溶液中彻底清洗的过程替换为采用温度为4-8℃的灭菌水清洗;2)进一步在1)的基础上,将消化液替换为本申请的消化液组成,并增加依次采用灭菌水、PBS溶液一和PBS溶液二清洗,并且PBS溶液一和PBS溶液二具有不同的成分组成及含量;3)进一步在2)的基础上,去掉“采用一定成分组成的M199培养基重悬细胞沉淀,接种到涂有牛胶原蛋白I的60mm细胞培养板中。置于37℃、5%CO2加湿培养箱中一天后,用含有Ca2+和Mg2+的DPBS洗涤培养板除去为附着的细胞碎屑并加入新鲜培养基。在第2天再次用DPBS洗涤细胞,并用含有10%胎牛血清、20mM HEPS和抗生素抗真菌组合(终浓度为100U/ml 青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/ml两性霉素B)每2-3天更换一次培养基, 培养10-12天后,用小鼠抗CD90抗体确定成纤维细胞污染的百分比,通常以< 10%CD90阳性细胞的培养物被认为可接受并重新接种至24孔板中。为了重新接种细胞,将培养基吸出后用DPBS洗涤2次,将2ml温热的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA添加到每个板中孵育12分钟,孵育后立即将细胞转移到装有4mL MEM培养基的50mL试管中,并在室温下200g离心5分钟,倒出上清液”的整个过程,而直接采用MEM培养基重悬细胞沉淀进行培养。至于审查员将这些过程都归纳为常规技术手段,所谓常规,一定是在针对瘤胃组织培养时,大家都这么操作才能称之为常规。本申请背景技术也阐述了现有培养瘤胃的方法通常是采用胰蛋白酶和EDTA消化瘤胃上皮组织,然后采用青链霉素、庆大霉素、链霉素或两性霉素等去除贴附瘤胃的微生物并使用DMEM完全培养基进行培养,该方法虽然能在一定程度上培养瘤胃上皮细胞,但获取的瘤胃上皮细胞的活性较差,含有一定比例的成纤维细胞瘤胃上皮,且经冻存复苏后使用活性较差。此外,现有的瘤胃上皮细胞培养时间普遍在细胞3‑6d开始贴壁,8‑10d才能完成铺层,说明细胞发育比较缓慢。而对比文件1的培养时间在15~17天,恰好验证了本申请背景技术中记载的现有培养瘤胃方法的问题。显然,本申请的技术手段根本不能称之为常规,而审查意见中也并未举出其它实质证据来证明本申请的这些手段就是常规。

其二,对比文件2公开的是羊羔瘤胃上皮细胞分离方法,其公开的胰蛋白酶消化液组成为:含2%胰蛋白酶、1.15 mmol/LCaCl2的KRB-HEPES,KRB-HEPES 为Krebs Ringer缓冲液(即对应所述Kreb-Ringer缓冲液)中添加25mmol/L HEPES。一方面,本申请的消化液中胰蛋白酶含量为 2.5~5%(w/v),CaCl2 1.08 mM,ABAM 2%(v/v),与对比文件2并不完全相同。另一方面,在对比文件1与本申请具有较大差距的前提下,即便结合对比文件2,也无法显而易见地获得本申请的整体技术方案。

其三,本发明获得了显著的技术效果,本申请能将培养时间缩短为2‑3d开始贴壁,4‑5d完成铺层,培养过程便捷且快速。对比文件1的培养时间达到15~17天,对比文件2只是研究羊羔瘤胃上皮细胞的分离方法。显然,本申请较比现有技术具有显著进步。

综上,本申请权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步, 具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。

申请人认为,以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷,希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处,恳请再给予修改/陈述意见的机会。

最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。