尊敬的审查员:

本意见陈述是针对国家知识产权局于20220525日发出的关于《检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒》的第一次审查意见通知书,对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。

一、修改说明

在原权利要求1中加入所述引物中GC%33.3%,引物3’端不存在碱基配对,ΔG=-0.7 kcal/mol

以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。

具体的修改内容详见权利要求书替换页。

二、意见陈述

1)修改后的权利要求1具有创造性

权利要求1请求保护一种染料荧光定量RT-PCR引物。对比文件1公开的是利用逆转录PCR检测哺乳动物呼肠孤病毒RNA:λ3-编码L1基因的序列多样性。权利要求1与对比文件1相比至少以下区别技术特征:引物序列完全不相同,并且本申请限定了“引物中GC%33.3%,引物3’端不存在碱基配对,ΔG=-0.7 kcal/mol”。

本申请的引物序列为:

上游引物MRV FTATATTGATGCTCTAAATCGTGTGSEQ ID NO:1

下游引物MRV RTTCTGGCTTGGCTATCTCCSEQ ID NO:2

对比文件1的引物序列为:

L1.rv5 (forward5'-GCATCCATTGTAAATGACGAGTCTG-3')

L1.rv6 (reversc5'-CTTGAGATTAGCTCTAGCATCTTCTG3')

L1.rv7 (forward5'-GCTAGGCCGATATCGGGAATGCAG-3')

L1.rv8 (reverse5'-GTCTCACTATTCACCTTACCAGCAG-3')

显然,本申请和对比文件1的序列结构存在较大差异,并且对比文件1GC含量明显较高,在50%以上。

针对上述区别技术特征,本申请实际要解决的技术问题为:提供简单、快速、灵敏度高和特异强的检测哺乳动物正呼肠孤病毒的荧光定量RT-PCR引物

为了解决上述技术问题,本申请设计合成了用于检测哺乳动物正呼肠孤病毒的荧光定量RT-PCR引物从而获得的技术效果为1该引物针对的基因靶标较比现有荧光定量PCR的引物针对的基因标靶更为精准:本发明设计的引物是基于MRV L1基因,在动物呼肠孤病毒中L1序列相对保守,更加适合用做引物的设计靶点。2引物设计的可检测范围更为广泛:本发明设计的引物是根据国内外公布的所有MRV病毒序列,能够同时对国内外现有的毒株进行检测,而设计范围在高度保守的L1序列。3)利用该引物,只需要常规的提取核酸,进行反转录后就能进行染料荧光定量PCR检测;整个扩增只需要2 h即可完成,检测的灵敏度达到7.58×103 copies/µL4)阳性结果鉴定便捷,只需要判断其CT值是否小于“35”即可;比现有检测MRV的核酸电泳或荧光定量PCR的方法更加快捷、准确,为哺乳动物呼肠孤病毒快速诊断和流行病学调查奠定了基础。

进一步地,审查意见中认为:对比文件2给出了可以针对靶标保守区域设计一对特异性引物,通过染料荧光定量RT-PCR方法完成靶标定量检测的技术启示,因此,本领域技术人员为了对呼肠孤病毒进行定量检测,容易想到针对呼肠孤病毒LI基因设计一对特异性引物应用于染料荧光定量RT-PCR方法中,实现对呼肠孤病毒的定量检测,具体可借助引物设计软件辅以合理有限的试验确认适宜的引物序列。那么,结合对比文件1、对比文件2和本领域常规技术手段即可显而易见地获得本申请的技术方案。

对此,申请人完全难以认同,具体分析如下。

其一,上文已经详细分析了本申请和对比文件1的引物序列结构差异,显然,即便本申请和对比文件1都是针对L1基因进行引物序列的设计,最终获得的引物序列结构也是千差万别,而这些引物序列用于正呼肠孤病毒的检测效果也只能通过实际实验验证,根本无法预期。那么在此前提下,对比文件2是根据GenBank中的ARV S1基因(序列号为AF330703)oC蛋白序列的保守区域设计了1对特异性引物,

上游引物: 5-TACGGTTGACGGAAACTCCAC-3'

下游引物: 5-ACACTAAGCGGAGGCGAAAA-3'

显然,对比文件2设计的该引物序列结构和本申请的引物序列结构也存在较大差异,那么在对比文件1、对比文件2均和本申请的引物序列存在较大差异的前提下,在对比文件1是针对L1基因设计引物,对比文件2是针对ARV S1基因设计引物的前提下,那么,两者又是如何进行结合,并显而易见地获得本申请的技术方案的呢?申请人实在不解。此外,引物的设计必然都是通过相关设计软件,而在利用这个软件对模板序列进行探索、对二聚体或发夹结构的形成进行探索、以及对目标核苷酸片段的探索本身就是一个创造性劳动过程。至于审查员认为的“辅以合理有限的试验确认适应的引物序列”,本申请与对比文件1、对比文件2的引物序列结构差异度不是一般的小,那么即便按照排列组合方式计算,至少也有上万种可能,每种都还要进行实际实验验证,这个过程可不能算是合理有限的试验。

其二,从本申请实施例3-4的验证结果来看,该引物序列对正呼肠孤病毒的RT-PCR反应最低检测量为:MRV毒株7.58×103 copies/µL,具有高度稳定性、可重复性和特异性。此外,和现有的常规PCR鉴定方法进行比较,检出率明显要高。因此,本申请具有显著的技术进步。

综上,本申请权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步, 具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。

2)权利要求2~4具有创造性

权利要求2保护的是一种染料荧光定量RT-PCR试剂盒,包括权利要求1所述的染料荧光定量RT-PCR引物,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求2也具备创造性。

权利要求3为权利要求2的从属权利要求,在权利要求2具备创造性的前提下,从属权利要求也具备创造性。

权利要求4保护的是权利要求1所述的染料荧光定量RT-PCR引物、或者权利要求23所述的染料荧光定量RT-PCR试剂盒在检测哺乳动物正呼肠孤病毒中的应用,也是直接或间接基于权利要求1的引物实现,在权利要求1具备创造性的前提下,权利要求4也具备创造性。

申请人认为,以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷,希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处,恳请再给予修改/陈述意见的机会。

最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。