尊敬的审查员:
本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年08月01日发出的关于《一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用》的第二次审查意见通知书,对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述,申请人进行了认真的研读,并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
在原权利要求1中加入技术特征“SEQ ID NO.2所示序列是在SEQ ID NO.1所示序列的基础上加了CACC四个碱基,SEQ ID NO.3所示序列是SEQ ID NO.2所示序列的互补序列”;
在原权利要求3中加入技术特征“SEQ ID NO.2所示序列是在权利要求2所述的识别序列的基础上加了CACC四个碱基,SEQ ID NO.3所示序列是SEQ ID NO.2所示序列的互补序列”。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围,符合专利法第三十三条的规定,且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改,符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
具体的修改内容详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1)修改后的权利要求1具有创造性
权利要求1请求保护一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株。对比文件1公开的是FaSSIF(喂食状态模拟肠液)对低水溶性化合物溶解度和溶解/渗透速率的影响。权利要求1相较于对比文件1至少具有以下区别特征:
1)本申请的人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO,于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC
NO.C202024。对比文件1并未报道构建了该细胞株。
2)本申请细胞株的构建方法为:通过CRISPR/Cas9技术构建,将核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示的单链DNA进行退火反应,得到双链DNA短片段,连接入CRISPR/Cas9载体,所述CRISPR/Cas9载体以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA作为识别序列,获得重组敲除载体,将重组敲除载体电转染到人结直肠腺癌细胞系中,经抗性和测序筛选获得人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO;其中,SEQ ID NO.2所示序列是在SEQ ID NO.1所示序列的基础上加了CACC四个碱基,SEQ ID NO.3所示序列是SEQ ID NO.2所示序列的互补序列。对比文件1研究了ABT-102在FaSSIF中的表观溶解度,以Caco-2细胞进行细胞培养获得的Caco-2模型作为屏障。
针对上述区别技术特征,本申请实际要解决的技术问题为:构建结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株。
为了解决上述技术问题,本申请通过CRISPR/Cas9技术,利用gRNA作为识别序列,将SEQ ID NO:2~3所示的单链DNA退火后连接入CRISPR/Cas9载体,精确且高效的敲除了TRPV1基因,有效的构建了一种TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系。从而解决了使用辣椒素受体拮抗剂的缺陷,为辣椒素降脂、降糖、抗炎症等功能的机理研究奠定物质基础。
进一步地,审查意见中认为:对比文件1公开了利用抑制剂获得TRPV1抑制的Caco-2细胞模型,本领域知晓抑制特定基因表达是基因工程常规的技术手段,常见的可供选择的操作有:小RNA抑制、抑制剂、基因敲除、基因突变等。本领域技术人员出于丰富抑制手段的考虑,也有动机从现有技术中获得常规的抑制基因的表达手段作用于对比文件1所述Caco-2细胞。在此基础上,对比文件2公开了利用基因敲除手段获得的动物,由此可知基因敲除的手段可以用于敲除TRPV1。因此,本领域技术人员不难想到利用基因敲除的手段对Caco2细胞的TRPV1基因敲除。而对其命名和保藏则是常规操作,不会改变细胞的组成和/或结构。
对此,申请人仍然难以认同,理由如下:
首先,对比文件1研究的是FaSSIF对悬浮液中难溶化合物ABT-102在Caco-2单分子膜上的表观溶解度和溶解/渗透速率的影响。审查员认为的Caco-2模型是通过Caco-2细胞培养获得,详见对比文件1第2.5段公开的内容:“Caco-2细胞在DMEM中培养,添加10%的FBS、1%的非必需氨基酸、1%的青霉素G、1%的链霉素和0.5%的环丙沙星,温度为37℃,二氧化碳浓度为5%。每隔一天向细胞提供新鲜培养基,每周传代一次。在实验中,利用了传代数为46到75之间的细胞。将细胞接种在密度约为75000/cm2的预涂层(鼠尾胶原)12孔transwell或96孔板(康宁股份有限公司,德国威斯巴登生命科学公司)上,并在37℃、5%CO2中培养14-16天,直到形成融合单层”。可见,Caco-2单分子膜的构建是通过细胞培养方式获取,本申请则是利用gRNA敲除TRPV1基因进行构建。
进一步地,对比文件2只记载了瞬时受体电位通道(TRPV1)在热性惊厥中的作用及其机制,采用的方法为:高热诱导C57BL/6野生型小鼠和TRPVI基因敲除鼠热性惊厥后:比较两组间热性惊厥行为学、脑电图及核心温度的差异;ELISA检测两组间大脑及经辣椒素和高热处理后BV2 细胞中炎性因子的表达差异。显然,对比文件2和对比文件1的技术手段完全不相同,本领域技术人员是如何结合两者进而获得本申请的技术方案,申请人实在是百思不得其解。退一步而言,即便本领域技术人员能够想到采用对比文件2的方式进行TRPVI基因敲除,但对比文件2是将小鼠模型进行TRPV1基因敲除,进而研究其热性惊厥行为学、脑内炎性因子表达变化,本申请则是通过CRISPR/Cas9技术,利用gRNA敲除TRPV1基因,进而构建人结直肠腺癌细胞系。显然,对比文件2和本申请从研究方向再到具体设计的方法完全不相同。申请人认为,审查员将对比文件1和对比文件2的这种硬性结合方式完全不符合审查指南中关于创造性的审查宗旨。
《审查指南》第二部分第四章第3.2.1小结规定:
“判断过程中,要确定的是现有技术整体上是否存在某种技术启示,即现有技术中是否给出将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题(即发明实际解决的技术问题) 的启示,这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时,有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明。”
综上所述,本申请权利要求1较比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步,具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。
2)修改后的权利要求2~6具有创造性
修改后的权利要求2保护的是一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列。结合权利要求1的阐述,本领域技术人员通过对比文件1、对比文件2结合常规技术手段无法显而易见地获得权利要求1的技术内容,那么在此基础上,本领域技术人员也无法通过常规手段获得用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列,即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。权利要求2也具备创造性。
权利要求3保护的是一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对,其具有创造性的理由同权利要求2。
权利要求4保护的是权利要求2所述的sgRNA的识别序列和/或权利要求3所述gRNA引物对在敲除TRPV1基因中的应用。是基于权利要求2和/或权利要求3的技术方案而实现,在权利要求2或3具有创造性的前提下,权利要求4也具有创造性。
权利要求5保护一种含有SEQ ID NO:2~3所示的gRNA引物对的质粒载体,其具有创造性的理由同权利要求2。
权利要求6保护的是权利要求5所述的质粒载体在构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株中的应用。是基于权利要求5的技术方案而实现,在权利要求5具有创造性的前提下,权利要求6也具有创造性。
申请人认为,以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷,希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处,恳请再给予修改/陈述意见的机会。
最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。