1. 一株糠醛等抑制物耐受酵母工程菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1、提取酵母单倍体菌株BY4742的基因组并扩增PDR1YAP1RPN4基因,进行胶回收;

步骤2、通过SpeISacII限制性内切酶对重组质粒pUG6-TEF1p-CYC1t进行双酶切,得到线性化的pUG6-TEF1p-CYC1片段,进行胶回收;同时通过SpeISacII限制性内切酶对YAP1片段进行双酶切以及纯化回收;

步骤3、采用T4 DNA连接酶,将双酶切的pUG6-TEF1p-CYC1t片段与双酶切的YAP1片段进行粘性末端连接体外构建重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上挑选出含重组质粒pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1t的阳性克隆子;将双酶切的pUG6-TEF1p-CYC1t片段与PDR1RPN4片段按照分子质量比为26~28混合后,分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞体内重组构建重组质粒,在含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上分别挑选出含重组质粒pUG6-TEF1p-PDR1-CYC1tpUG6-TEF1p-RPN4-CYC1t的阳性克隆子;pUG6-TEF1p-PDR1-CYC1tPsiI单酶切以及鉴定引物扩增进行鉴定,pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1tBamHI单酶切以及鉴定引物扩增进行鉴定,pUG6-TEF1p-RPN4-CYC1tPsiI单酶切以及鉴定引物扩增进行鉴定;

步骤4、将PsiI酶切线性化的pUG6-TEF1p-PDR1-CYC1t通过同源重组方式整合进权利要求1所述的出发菌株YB-A-6-1染色体中,在含有200 μg/mL G418的抗性YPD平板上挑选阳性酿酒酵母单菌落进行PCR鉴定,阳性菌株命名为P菌株;

步骤5、通过EcoRV单酶切克隆载体pRS42H并进行胶回收,线性化pRS42H片段大小为6217 bp;用表达盒扩增引物分别扩增pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1tpUG6-TEF1p-RPN4-CYC1t重组质粒上的TEF1p-YAP1-CYC1tTEF1p-RPN4-CYC1t过表达盒,并进行胶回收;

步骤6、将线性化pRS42H片段与TEF1p-YAP1-CYC1t过表达盒,按照分子质量比为26~28混合转化大肠杆菌DH5α细胞,体内重组构建重组质粒,在含100 mg/L的氨苄青霉素的LB固体平板上挑选出含重组质粒pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1t的阳性克隆子,EcoRV单酶切鉴定以及用鉴定引物进行PCR扩增鉴定;

步骤7、将EcoRV线性化的pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1tTEF1p-RPN4-CYC1t过表达盒,按照分子质量比为26~28混合转化大肠杆菌DH5α细胞,体内重组构建重组质粒,在含100 mg/L的氨苄青霉素的LB固体平板上挑选出含重组质粒pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1t-TEF1p-RPN4-CYC1t的阳性克隆子,EcoRV单酶切鉴定以及用鉴定引物进行PCR扩增鉴定;

步骤8、将最后所得的环状pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1t-TEF1p-RPN4-CYC1t重组质粒转化到P菌株细胞浆中,在含300 μg/mL潮霉素的抗性平板上挑选阳性工程菌PYR,用鉴定引物进行PCR扩增鉴定,确定目标工程菌PYR是否含有3个过表达盒,获得最终的转录调控基因PDR1YAP1RPN4的联合过表达PYR菌株;

所述的糠醛等抑制物耐受酵母出发菌株,命名为YB-A-6-1YBA_08),分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);于2019614日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No. 17929

所述步骤1中的PDR1基因的扩增引物为ScPDR1_FScPDR1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示; RPN4基因的扩增引物为ScRPN4_FScRPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示;YAP1基因的扩增引物为ScYAP1_FScYAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示;

所述的步骤3中的pUG6-TEF1p-PDR1-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-PDR1_FiTEF1p-PDR1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1112所示;pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-YAP1_FiTEF1p-YAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1314所示;pUG6-TEF1p-RPN4-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-RPN4_FiTEF1p-RPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1516所示。

2. 根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的步骤5中的pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1t表达盒扩增引物为hcYAP1_FhcYAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示;pUG6-TEF1p-RPN4-CYC1t表达盒扩增引物为hcRPN4_FhcRPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.910所示。

3. 根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的步骤6中的含重组质粒pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1t的阳性克隆子的鉴定引物为iTEF1p-YAP1_FiTEF1p-YAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1314所示。

4. 根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤7中的含重组质粒pRS42H-TEF1p-YAP1-CYC1t-TEF1p-RPN4-CYC1t的阳性克隆子的鉴定引物为iTEF1p-YAP1_FiTEF1p-YAP1_RiTEF1p-RPN4_FiTEF1p-RPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.13-16所示。

5. 根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的步骤8中的鉴定引物为iTEF1p-PDR1_FiTEF1p-PDR1_RiTEF1p-YAP1_FiTEF1p-YAP1_RiTEF1p-RPN4_FiTEF1p-RPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.13-18所示。