尊敬的国家知识产权局:

申请人收到了国家知识产权局对申请号为201910848577.0发出的第二次审查意见通知书。申请人首先感谢审查员对完善本专利申请所作的辛勤劳动,申请人仔细阅读了审查意见通知书正文,按通知书的要求进行了修改,申请人提出以下意见,希望和审查员商榷:

一、修改说明:

1、将原权利要求13-4中的附加技术特征加入到权利要求2中,修改为权利要求1

2、删除权利要求13-49

二、修改后的权利要求1的创造性

修改后的权利要求1与对比文件1的区别在于:糠醛等抑制物耐受酵母工程菌的构建方法;

所述的糠醛等抑制物耐受酵母出发菌株,命名为YB-A-6-1YBA_08),分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);于2019614日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No. 17929

所述步骤1中的PDR1基因的扩增引物为ScPDR1_FScPDR1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示; RPN4基因的扩增引物为ScRPN4_FScRPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示;YAP1基因的扩增引物为ScYAP1_FScYAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示;

所述的步骤3中的pUG6-TEF1p-PDR1-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-PDR1_FiTEF1p-PDR1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1112所示;pUG6-TEF1p-YAP1-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-YAP1_FiTEF1p-YAP1_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1314所示;pUG6-TEF1p-RPN4-CYC1t的鉴定引物为iTEF1p-RPN4_FiTEF1p-RPN4_R,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1516所示。

基于上述区别技术特征,本发明工程菌对糠醛耐受能力的提高具体表现为细胞壁抗性的明显增强,依赖于NADH作为辅酶的醛还原酶比活力的显著提高,以及一系列与有毒物质外排、细胞壁和细胞膜成分合成、蛋白质折叠、核苷酸合成等相 关基因的显著上调转录表达。通过上述方法构建的工程菌对5-基糠醛、乙酸、苯酚、乙醇以及玉米秸秆水解液 10 中的抑制物等的耐受能力均有所增强,可作为较良好的工业发酵底盘菌株,具有用于第二代生物燃料乙醇以及以木质纤维素水解液为原料的其它生物 基化学品工业化生产的应用潜力。本发明通过转录调控基因联合过表达构建酿酒酵母工程菌,为从基因表达层面改造酵母菌株提供了技术手段。

对比文件1没有公开上述区别技术特征糠醛等抑制物耐受酵母出发菌株,也没有上述技术效果,且上述区别技术特征也不是本领域的公知常识,因此,修改后的权利要求1相对于对比文件1和公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步,因而,也具有创造性。

三、关于修改后的权利要求2-5的创造性

权利要求2-5与修改后的权利要求1具有创造性,因此,在修改后权利要求1具有创造性的前提下,权利要求2-5也必然具有创造性。

综上所述,本申请文件公开的技术方案具有突出的实质性特点和显著的进步,符合专利法22.331.1的单一性的规定。如有问题,望及时联系申请人或代理人17748496989,给予再次答复的机会。

请审查员继续审查。

致礼

                          申请人:四川农业大学

                              20221109