尊敬的审查员：
本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年08月01日发出的关于《一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用》的第一次审查意见通知书，对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述，申请人进行了认真的研读，并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求1和8合并成新权利要求1；
删除原权利要求10中“化妆品、保健品”应用的技术特征；
将相关权利要求作相应的适应性修改。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围，符合专利法第三十三条的规定，且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改，符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
具体的修改内容详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1、修改后的权利要求1具有创造性
权利要求1请求保护一种人胎盘间充质干细胞的制备方法。对比文件1公开的是一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法。权利要求1与对比文件1相比至少以下区别技术特征：
（1）本申请进行人胎盘间充质干细胞制备的材料为胎盘绒毛膜，对比文件1采用的是胎盘绒毛板。胎盘绒毛膜和胎盘绒毛板都属于胎盘组织的组成部分，但并不是相同的组织。
（2）本申请在处理获得1~3mm2的组织块后，将组织块直接使用爬片法以每瓶≧200块的密度均匀接种，然后于37℃、5％CO2条件下培养3~5小时，然后加入含10%胎牛血清的完全培养基继续培养获得人胎盘间充质干细胞原代细胞。
对比文件1在获得0.5-5mm2的组织块后先将其加入组织消化液中，于37℃、100-200r/min条件下消化1-2h；组织消化完后加入完全培养基终止消化，去除未消化完全的胎盘组织，所得细胞按1×104 -2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养获得第一代培养细胞。
（3）本申请的完全培养基组成为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10%的胎牛血清。
对比文件1的完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM和15％的胎牛血清。
（4）本申请还限定了将足月胎盘组织保存在含4万IU/L硫酸庆大霉素的胎盘保护液中；以及将剪取的胎盘绒毛膜放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡10~15s，取出后用D-Hanks溶液清洗；以及将获得的原代细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心处理收集细胞，计数后按1×104~2×104个细胞/cm2的密度接种，然后添加完全培养基置于37℃、5％CO2潮湿培养箱中传代培养；当传代培养的细胞达到80%以上融合时进行细胞冻存。
对比文件1未对胎盘保护液以及将剪取的胎盘绒毛膜放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡、清洗等技术特征进行限定；并且是在第一代培养细胞融合度达到70-90％时，用0.25％胰酶消化细胞，离心后收集细胞，按1×104 -2×104个细胞/cm2 的密度接种于T175培养瓶中，然后添加完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；进行检测后冻存。
（5）本申请还有细胞复苏的过程：取出冻存管于37℃融化，加入D-Hanks溶液混匀后离心，去除含有的冻存液和胎牛血清，加含10％胎牛血清的完全培养基重悬细胞，并于体积分数为5%CO2、温度为37℃静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功。
对比文件1未做细胞复苏的限定。
显然，本申请与对比文件1的技术方案存在较大差距。
针对上述区别技术特征，本申请实际要解决的技术问题为：提供工艺流程更加简单的人胎盘间充质干细胞的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明以人胎盘绒毛膜为材料提取间充质干细胞，从采集、分离到培养过程中层层把关，在保护液中添加硫酸庆大霉素，分离过程中对胎盘组织进行酒精浸泡，有效的减少霉菌、细菌的污染几率，同时选用硫酸庆大霉素也避免了细胞移植过程中可能引起的过敏反应。并且主要通过人胎盘绒毛膜组织块爬片法，进而通过一种工艺简单、生产成本低廉的制备方法获得胎盘间充质干细胞。
进一步地，审查意见中认为：为了抑制杂菌污染营造无菌环境，本领域技术人员容易想到在采集的胎盘中添加抗生素，抗生素的具体种类和用量是常规选择。将胎盘组织采用酒精浸泡、清洗液、冻存细胞的复苏等为本领域技术人员容易想到的常规操作。在对比文件1公开原代培养、传代培养和冻存的基础上，本领域技术人员容易常规调整。
对此，申请人完全难以认同，具体理由为：
其一，上文的区别技术特征显示本申请与对比文件1差距较大。根据专利审查指南的宗旨，创造性的判断应当整体看待对比文件1的技术方案，那么，基于上文中的区别技术特征，对比文件1并未启示或者教导：1）以胎盘绒毛膜作为制备人胎盘间充质干细胞的材料；2）获得组织块后，不进行消化，而是直接采用爬片法进行组织块培养；3）在完全培养基中加入终浓度为0.025ug/ml的Egf，以及将胎牛血清的含量降低。显然，该启示或者教导并不能显而易见地获得本申请的相关技术特征。进一步地，对比文件1的背景技术中还指出：“中国专利CN104560869A公开了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，该方法通过剪取羊膜下0-1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后通过胶原酶消化获取绒毛膜间充质干细胞。该方法所获得的胎盘组织包含绒毛板、绒毛层、母血细胞成分，所获得的绒毛膜间充质干细胞实际上是绒毛板间充质干细胞、绒毛间充质干细胞、母血细胞的混杂成分，因此并不能单纯地认为是绒毛膜间充质干细胞，而且绒毛层胎盘组织的引入使得组织分离过程中红细胞需要大量清洗液和清洗过程，增加了操作过程的难度。中国专利CN102676451A公开了从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法采用组织消化酶从胎盘小叶获取间充质干细胞。该方法中的胎盘小叶实际上包括了胎盘绒毛板、绒毛层、基板、母血细胞成分，提取的间充质干细胞是多种细胞的混杂成分，需要后续的纯化工艺进行分离”，可见，对比文件1的背景技术详细介绍了绒毛板层和绒毛层（即绒毛膜层）的区别，以及采用绒毛膜组织制备间充质干细胞存在的问题和缺陷，基于该问题和缺陷，对比文件1采用绒毛板组织进行间充质干细胞的培养。那么，本领域技术人员在参考对比文件1的技术方案后，很容易产生一种技术偏见，即到采用胎盘绒毛膜可能不能获得纯粹的间充质干细胞。而本申请显然就是要克服该技术偏见。
其二，现有常规胎盘间充质干细胞培养方法都是将组织块先消化成单细胞，然后再进行培养以及后续的传代。而本申请则是直接采用爬片法对组织块进行培养，显然，在现有常规胎盘间充质干细胞培养方法的教导下，在对比文件1背景技术已经阐述“现有培养方法所获得的绒毛膜间充质干细胞实际上是绒毛板间充质干细胞、绒毛间充质干细胞、母血细胞的混杂成分，因此并不能单纯地认为是绒毛膜间充质干细胞”的前提下，本领域技术人员根本不可能想到还采用未经消化的组织块直接采用爬片法培养。而本申请在制备胎盘间充质干细胞的过程中，从采集、分离到培养过程中层层把关，在保护液中添加硫酸庆大霉素，分离过程中对胎盘组织进行酒精浸泡，有效的减少霉菌、细菌的污染几率，同时选用硫酸庆大霉素也避免了细胞移植过程中可能引起的过敏反应。在对人胎盘绒毛膜取材时剪取脐带周围富含间充质干细胞的绒毛膜，并彻底去除绒毛膜下层的毛细血管，进而保证所获得的间充质干细胞活性较好、种类单一。整个制备过程的各个技术特征彼此相辅相成，缺一不可。
其三，本申请获得了显著的技术效果，本申请的制备方法工艺简单，生产成本低廉，所获得的间充质干细胞通过生物学鉴定确认其符合间充质干细胞的特点，同时通过成脂与成骨诱导分化实验再次验证了其具有多向分化的潜能。在本申请实施例部分，实施例2证实了采用爬片法对组织块进行贴壁培养，7天后有少量细胞爬出组织块，培养14天后有大量细胞爬出组织块。实施例3证实了传代多次的细胞生长发展趋势，实施例6则证实了：1）P2~P20代细胞流式检测结果CD45及HLA-DR检测值均≦2%，CD73及CD105检测值均≧95%，均符合目前认可度较高的ISCT(国际细胞治疗协会)间充质干细胞委员会制定的一系列标准；2）所获得的人胎盘间充质干细胞具有成脂分化潜能和成骨分化潜能。
综上，本申请权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步， 具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。
2、修改后的权利要求2-9具有创造性
修改后的权利要求2~7为权利要求1的从属权利要求，在其引用的主权项具备创造性的前提下，权利要求2~7也具备创造性。
修改后的权利要求8请求保护的是一种人胎盘间充质干细胞，是采用权利要求1~7任意一项权利要求所述的制备方法制备，在权利要求1~7具备创造性的前提下，权利要求8也具备创造性。
修改后的权利要求9请求保护的是权利要求8所述的人胎盘间充质干细胞在治疗疾病的细胞制剂、药品上的应用。在权利要求8具备创造性的前提下，权利要求9也具备创造性。
申请人认为，以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷，希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处，恳请再给予修改/陈述意见的机会。
最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。