尊敬的审查员：
本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年09月29日发出的关于《一种牛纽布病毒重组VP1基因、重组蛋白及其应用》的第二次审查意见通知书，对于审查员在第二次审查意见通知书中的论述，申请人进行了认真的研读，并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
删除原权利要求3；
根据说明书实施例1制备牛纽布病毒重组VP1基因蛋白的方法中具体步骤，将部分技术内容补入权利要求1。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围，符合专利法第三十三条的规定，且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改，符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
具体的修改内容详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1）权利要求1具有创造性
权利要求1请求保护一种制备牛纽布病毒重组VP1基因蛋白的方法。对比文件1公开的是纽布病毒B0/LN-13/18/CH株VP1的氨基酸序列。权利要求1与对比文件1相比至少以下区别技术特征：
本申请制备牛纽布病毒重组VP1基因蛋白的方法包括：
（1）提取牛纽布病毒核酸后进行RT-PCR，拼接扩增序列，然后进行优化，得到SEQ ID NO：3所示的核酸序列，在其5’增加酶切位点Nde
I，3’增加酶切位点Xho I，N端添加His标签，Nde I和Xho I位点序列为CATATG和CTCGAG，合成整个序列；
（2）将步骤（1）得到的核酸序列与pET-28H载体分别酶切后连接转化TOP10感受态，获得重组原核表达载体pET-28H-VP1；
（3）pET-28H-VP1表达质粒转化BL21，涂布LB固体培养基，于恒温培养箱中37℃过夜培养；再挑单克隆菌落接入LB液体培养基于37℃振摇培养10h；
（4）步骤（3）获得的菌种接入LB液体培养基，37℃振摇培养至OD为0.6~0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于37℃诱导6h，离心收集菌体，加入PBS重悬，超声破碎、离心后分别收集上清和沉淀，沉淀用包涵体溶解液溶解；
所述包涵体溶解液按照终浓度的组成为：8mol/LUrea，50mmol/LTris-HCl，300mmol/LNaCl，pH8.0；
（5）采用HisCap 6FF镍离子纯化柱对步骤（4）获得的沉淀-包涵体溶解液进行纯化，收集到的组分依次经6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、0mol/L尿素梯度透析复性，最终透析至含有终浓度为50mmol/LTris、300mmol/LNaCl、pH8.0的溶液中，经过PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤，得到牛纽布病毒重组VP1基因蛋白。
对比文件1公开了纽布病毒B0/LN-13/18/CH株VP1的氨基酸序列，其第243-791位氨基酸与本申请牛纽布病毒VP1基因编码氨基酸的有一个氨基酸不同。
一方面，对比文件1并未公开重组VP1基因蛋白的详细制备方法，而制备方法对重组VP1基因蛋白的获得至关重要；另一方面，即便对比文件1与本申请在第243-791位仅有一个氨基酸不同，也会导致其各自编码核酸序列发生较大变化。因此，本申请和对比文件差距较大。
针对上述区别技术特征，本申请实际要解决的技术问题为：如何更好的获得牛纽布病毒重组VP1基因蛋白。
为了解决上述技术问题，本申请开发了制备牛纽布病毒重组VP1基因蛋白的方法：提取牛纽布病毒核酸后进行RT-PCR，拼接扩增序列，然后进行优化，得到SEQ ID NO：3所示的核酸序列；在其5’增加酶切位点Nde I，3’增加酶切位点Xho I，N端添加His标签，Nde
I和Xho I位点序列为CATATG和CTCGAG，合成整个序列；将得到的核酸序列与pET-28H载体分别酶切后连接转化TOP10感受态，获得重组原核表达载体；将所得到的重组原核表达载体转化大肠杆菌表达感受态细胞，用IPTG于20℃过夜诱导重组VP1基因蛋白表达，将所表达的蛋白回收并纯化即得。该制备方法弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。并且无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率，具有显著的技术效果。
进一步地，审查意见中进一步指出：1、对比文件1公开了纽布病毒B0/LN-13/18/CH株VP1的氨基酸序列。本领域技术人员有动机根据该VP1氨基酸序列通过序列检测等常规基因分析手段获得分类学地位相同的其他纽布病毒的VP1氨基酸序列，即本申请权利要求1基因编码的氨基酸序列，并基于密码子编码原则，进行常规设计获得本申请的VP1基因。2、对重组基因进行宿主细胞的表达是本领域的常规操作，并且利用pET-28H和VP1基因转入感受态构建原核表达载体，再转入大肠杆菌进行诱导表达纯化回收目的蛋白。其中具体的细节参数是本领域技术人员可以根据实际情况常规调整得到的。
对此，申请人完全难以认同，具体分析如下。
其一，针对上述观点1和2，对比文件1只是公开了纽布病毒B0/LN-13/18/CH株VP1的氨基酸序列，其并未启示或者教导如何对该氨基酸序列进行相应的改造或优化，进而获得SEQ ID No：3所示的VP1编码基因，也未启示和教导如何选择载体、如何对重组菌株的培养过程进行优化比如加入IPTG进而更好的获得牛纽布病毒重组VP1基因蛋白。审查意见认为的本领域技术人员有动机获得SEQ ID NO：3所示的核酸序列，并在其两端引入酶切位点和His标签，并且利用pET-28H和VP1基因构建原核表达载体，可以常规操作将载体和序列转入感受态获得表达载体，并再转入大肠杆菌进行诱导表达纯化回收目的蛋白，该观点只是一种推测，基因改造的方式千变万化，可用于重组蛋白的载体也很多，重组菌株的培养过程优化手段也不少，为何就一定能够想到本申请的这种方式呢？审查员的这种观点显然是一种臆断。申请人也可以合理的认为：审查员是在知晓本申请的发明目的、技术方案和效果之后，受本申请整体发明构思的启示而倒推得到，完全不符合审查指南中关于创造性判断的宗旨。
进一步地，本申请具体实施例1中比对了步骤4中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，一组20℃诱导过夜，另一组37℃诱导6h，同时以不添加IPTG组作为阴性对照，来考察所获得的的融合蛋白是否以包涵体形式表达，结果如图2所示，显示只有加入0.5mmol/L的IPTG、并且37℃诱导6h的试验组的融合蛋白才以包涵体形式表达。可见，重组菌株的优化培养过程并非常规技术手段。
因此，即便结合对比文件1和常规技术手段也并不能显而易见地获得本申请制备牛纽布病毒重组VP1基因蛋白的方法。
其二，本发明获得了显著的技术效果，总结如下：
1）成本低：原核表达系统比真核系统更廉价。
2）易于推广：原核表达使用的试剂材料容易获得，且无需特殊仪器，在所有实验室均可操作，同时生产周期短，易于形成产业化的规模，适合推广使用。
3）更省时：本发明的表达菌株培养方式简单，培养周期短，可在几天时间内合成大量重组蛋白。
4）更高效：原核表达系统可以短期内获得大量优良的重组蛋白。抗原蛋白通过原核表达系统表达成包涵体，包涵体在变性条件下纯化，然后复性再折叠，再进过自我组装等过程而有效制备，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。
5）更方便：在构建表达载体时，目的基因通常由临床样本或实验室培养物中直接扩增后克隆转化，扩增受样本处理方式和核酸浓度影响大同时需要一对可完全扩增目的基因的引物。本发明在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。
6）更安全：本发明是非复制型的，在机体内不增殖，不存在散毒危险。
而本申请具体实施例1证实了重组VP1蛋白具有生物活性和良好的免疫原性，实施例2则证实该重组VP1蛋白能够成功应用于牛纽布病毒抗体的间接ELISA检测，显然上述技术效果较比现有技术显著。
综上，本申请权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步， 具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。
2）修改后的权利要求2具有创造性
修改后的权利要求2保护的是一种牛纽布病毒抗体检测试剂盒，是基于权利要求1制备得到的牛纽布病毒重组VP1基因蛋白实现，在权利要求1具备创造性的前提下，权利要求2也具备创造性。
申请人认为，以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷，希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处，恳请再给予修改/陈述意见的机会。
最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。