尊敬的审查员：
本意见陈述是针对国家知识产权局于2022年08月02日发出的关于《牛冠状病毒HE基因重组株及其制备的灭活疫苗和应用》的第一次审查意见通知书，对于审查员在第一次审查意见通知书中的论述，申请人进行了认真的研读，并作出以下修改和意见陈述。
一、修改说明
将原权利要求6、7、9合并成新权利要求6；
将相关权利要求作相应的适应性修改。
以上修改均未超出原说明书和原权利要求书所记载的范围，符合专利法第三十三条的规定，且上述修改也是针对审查意见通知书所指出的缺陷进行修改，符合专利法实施细则第五十一条三款规定。
具体的修改内容详见权利要求书替换页。
二、意见陈述
1、权利要求1具有创造性
权利要求1请求保护一株命名为BCoV-LNA1株牛冠状病毒HE基因重组株。对比文件1公开的是具有重组血凝素/酯酶基因的新型牛冠状病毒株在中国奶牛中的流行情况研究。权利要求1与对比文件1相比具有以下区别技术特征：
本申请的BCoV-LNA1菌株于2019年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO:V202016，分类命名：牛冠状病毒BCoV-LNA1-SWUN7901。
针对上述区别技术特征，本申请实际解决的技术问题为：提供可以制备牛冠状病毒疫苗的牛冠状病毒HE基因重组株。
进一步地，审查意见中认为：1、对比文件1公开的分离自四个省份的8个农场的HE重组菌株的重组信息如断点、交叉位点位置等，以及该HE重组菌株已在中国奶牛中广泛传播，结合本领域常规技术手段，本领域技术人员能够容易地分离鉴定得到经历了与对比文件1中HE基因重组株具有相同的重组事件并携带相同重组位点的牛冠状病毒HE基因重组株，并且可以常规选择保藏单位进行生物保藏，由此获得相应的保藏信息如保藏编号、分类命名等，且不存在技术困难。2、在技术效果方面，依据本申请实施例2、3的记载，本领域技术人员并不能获知上述两种灭活疫苗中牛冠状病毒的相对含量，而灭活疫苗的免疫效力如产生的中和抗体水平显然与灭活疫苗中的病毒含量密切相关，在无法确认上述两种疫苗中牛冠状病毒的相对含量的前提下，得出二者的免疫效力孰强孰弱的结论显然是无法令人信服的，由此，依据本申请说明书的记载也无法确认权利要求1请求保护的牛冠状病毒HE基因重组株能够产生预料不到的技术效果。
对此，申请人完全难以认同，具体理由为：
其一，针对上述观点1，对比文件1主要研究的是：从中国六个省的14个农场收集190份患有腹泻的奶牛粪便样本，通过逆转录酶-聚合酶链反应在18.95%（36/190）的样本中检测到了BCV。从13个临床样本（四个省中的八个农场）中同时克隆了福伦氏刺突、血凝素/酯酶（HE）核衣壳和跨膜基因，根据这些基因的系统发育分析，大多数BCV管理蛋白显示出独特的进化模式。13个菌株中有10个被鉴定为HE重组菌株，这些菌株经历了相同的重组事件，并携带位于酯酶和凝集素结构域之间的相同重组位点。它们在R2环中也共享一个相同的aa变体（F181V）。此外，9/10株菌株在HE基因的相邻R1环中显示了另一个相同的aa变体（P，S158A），这与GenBank数据库中其他可用的BCoV
HE序列不同。所有13个菌株的HE基因都有1275个碱基，编码424个氨基酸。并且对比文件1的研究主要是到农场进行腹泻乳牛的取样以及对所提取的菌株进行BCoV基因的具体研究，并不涉及动物实验，这一点对比文件1中有原文记载。那么，从对比文件1目前公开的内容，根本无法确定本申请所获得的牛冠状病毒HE基因重组株和对比文件1的菌株是否同源，更加无法确定其所提取的13个菌株是否具备开发成疫苗的潜质，至于菌株的保藏，前提一定是该菌株能够具备开发成疫苗的潜质才会去保藏，而研究菌株开发成疫苗的这个过程一定是要付出创造性劳动的。
其二，针对上述观点2，本申请实施例2中详细公开了灭活疫苗的制备包括：1、制苗用病毒液的增殖：将实施例1分离的牛冠状病毒HE基因重组株BCoV-LNA1株经Vero细胞培养增殖，当细胞病变达到80%时，收获增殖的病毒液，反复冻融3次，置-80℃保存备用；2、灭活疫苗的制备：将上述收获的病毒液加入终浓度为0.5％的β-丙内酯，37℃灭活12h。将灭活检验合格的牛冠状病毒HE基因重组株BCoV-LNA1株病毒液，按照与201佐剂体积比=1:1的比例混合，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30 分钟，再静止30分钟，制备成牛冠状病毒灭活疫苗。此外，实施例1详细公开了病毒分离的过程：在细胞培养皿中使用含有10 %胎牛血清（购于GIBCO公司）和1 %青链霉素双抗的DMEM培养基培养Vero细胞，然后将上述病料按照20 %（v/v）比例与孵育液混合后接种于铺满80 %单层的Vero细胞中，孵育液为含有终浓度为2μg/mL胰蛋白酶和1 %双抗，且不含胎牛血清的DMEM培养基。于37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育1 h，然后使用维持液维持Vero细胞生长，维持液为含有终浓度为1μg/mL胰蛋白酶和1 %双抗，且不含有胎牛血清的DMEM培养基，逐日观察至发生细胞病变（CPE）。结果，在病料接种培养72h时， Vero单层细胞培养物出现CPE，表现为细胞呈长梭状改变，间界限模糊，成团紧密聚集，大小不规则，细胞融合形成合胞体以及“山脊状”病变现象。继续培养，当细胞病变达到80％左右时（即168h），收获病毒液。那么根据前述公开的内容，本申请公开的灭活疫苗中病毒含量也是既定的，本领域技术人员完全可以通过上述内容确定，而且本申请实施例部分的表1和表2的数据也是确定的，根据上述灭活疫苗的制备方法也很容易验证这些数据的结果。因此，申请人不认为本案的技术效果会让本领域技术人员产生任何不确定的地方，如果审查员认为有问题，欢迎采用本申请公开的方法进行验证，而非口头推断！
综上，本申请权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步， 具备专利法第22 条第3 款规定的创造性。
2、权利要求2具有创造性
修改后的权利要求2为权利要求1的从属权利要求，在其引用的主权项具备创造性的前提下，权利要求2也具备创造性。
3、权利要求3具有创造性
权利要求3请求保护权利要求1或2所述的一株牛冠状病毒HE基因重组株在制备牛冠状病毒疫苗中的应用。对比文件2公开的灭活型疫苗含有BECV分离物或从其得到的抗原，BECV和本申请的牛冠状病毒HE基因重组株并不相同，那么通过对比文件2公开的内容，本领域技术人员并不显而易见地获得通过牛冠状病毒HE基因重组株制备牛冠状病毒疫苗的技术内容。因此，权利要求3也具备创造性。
4、权利要求4-5具有创造性
权利要求4-5请求包含权利要求1或2所述的一株牛冠状病毒HE基因重组株制备的牛冠状病毒疫苗。其具有创造性的理由同权利要求3。
5、权利要求6-7具有创造性
权利要求6-7请求保护权利要求4或5所述的牛冠状病毒疫苗的制备方法，如前所述，对比文件2公开的是采用BECV分离物或从其得到的抗原制备灭活疫苗，请所涉及的菌株和本申请完全不同，本领域技术人员并不能显而易见地获得本申请通过牛冠状病毒HE基因重组株制备牛冠状病毒疫苗的技术内容。因此，权利要求6-7也具备创造性。
申请人认为，以上陈述克服了审查意见中所指出的所有缺陷，希望审查员以此为基础继续审查该发明申请并予以授权。如果审查员认为本申请仍有不符合专利法规定之处，恳请再给予修改/陈述意见的机会。
最后对审查员认真细致的工作再次表示感谢。